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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr细菌基因组基因P不出来怎么回事，条件见帖子。
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wsshforget

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr细菌基因组基因P不出来怎么回事，条件见帖子。

我将TET基因整合到细菌的基因组上，但是一直P不出来，抗生素筛选能选出来菌种，是不是因为变性时间不够吗？
我的体系是
buffer 2.5微升 (加有mg2+)
dntp        2
PF            1
PR            1
rtag          0.25
模版     挑取单菌落
ddH2O      18.25
总体积    25微升


PCR条件
94  5min
94  40s
52   30s
72   1min30s
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1楼 2009-12-31 16:47:23
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 12-31 21:13
是菌落PCR验证吗？
建议可以用菌液PCR。就是把你挑的单菌落培养几个小时，然后取3至5微升煮沸变性后，做模板，按正常的条件PCR即可。
估计是基因没有被整合进去的可能性比较大。
还有，楼主，你的dNTP用量有点多了，也可能会抑制酶活，取1微升就很足够了。
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2楼2009-12-31 20:57:26
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
变性时间该是够了

其他的不清楚，经验也不多
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3楼2009-12-31 20:58:54
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的目的是什么啊？
鉴定吗？
如果是，可以交给测序公司做吧，测个序就知道对不对啦。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
4楼2009-12-31 21:37:59
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wsshforget

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2009-12-31 20:57:
是菌落PCR验证吗？
建议可以用菌液PCR。就是把你挑的单菌落培养几个小时，然后取3至5微升煮沸变性后，做模板，按正常的条件PCR即可。
估计是基因没有被整合进去的可能性比较大。
还有，楼主，你的dNTP用量有点 ...

偶尔能P出来，就算P出来的时候也有杂带，大部分情况下P不出来，换了引物后还是P不出来，很是怪异。
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5楼2010-01-01 21:35:47
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Milanmy

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌落PCR和菌液PCR都是一样的，建议10微升水挑取单菌落后98度10分钟裂解细菌，之后补入PCR其它成分。还有经常会遇到PCR产物用原来的引物P不出来的情况。
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6楼2010-01-02 19:32:41
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wsshforget

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Milanmy at 2010-1-2 19:32:
菌落PCR和菌液PCR都是一样的，建议10微升水挑取单菌落后98度10分钟裂解细菌，之后补入PCR其它成分。还有经常会遇到PCR产物用原来的引物P不出来的情况。

如果遇到原来的引物P不出来应该怎么解决？重新合成引物还是可以通过其他手段解决？
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7楼2010-01-04 14:13:23
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有做过基因组菌落pcr,不知道和质粒的菌落pcr有区别吗。我在做质粒的菌落pCR时，变性时间用7分钟，能做出来。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
8楼2010-01-04 14:41:08
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Milanmy

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果原来的引物P不出来，我觉得可能是PCR产物发生了降解，我遇到过测序结果中找不到引物或者引物不全的情况，估计是在做连接前DNA两端降解的缘故。我一般连接完T载体，做菌落PCR时用T载的测序引物，也就是用载体序列设计引物，看产物大小是否正确，如果正确就去测序。这样也挺方便的，尤其是一次做很多不同连接的情况，省着分别加引物了。
如果降解的比较严重，那就重做一遍，从PCR开始。这个应该不是引物的问题，不需要重合引物。
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9楼2010-01-04 16:57:44
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gandalf886

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的菌是什么菌，如果是大肠的话把变性时间延长为10min；
如果是革兰氏阳性菌，还是提基因组再做PCR鉴定吧，阳性菌菌落PCR偶尔能P出来，可是极度不稳定。
另外，可能有些菌对四环素会产生较多的自发突变抗性，建议获得转化子后在四环素平板上连续传三代，选取生长好的再摇菌提基因组PCR鉴定。
还有，2楼的，他的dNTP浓度都没写你怎么知道加多了。如果是2.5mM each的话，25uL体系加2uL正好。
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10楼2010-01-04 17:17:54
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