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wsshforget

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】pcr细菌基因组基因P不出来怎么回事，条件见帖子。

我将TET基因整合到细菌的基因组上，但是一直P不出来，抗生素筛选能选出来菌种，是不是因为变性时间不够吗？
我的体系是
buffer 2.5微升 (加有mg2+)
dntp       2
PF          1
PR          1
rtag       0.25
模版    挑取单菌落
ddH2O    18.25
总体积 25微升

PCR条件
94  5min
94  40s
52 30s
72 1min30s

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1楼 2009-12-31 16:47:23

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Milanmy

银虫 (小有名气)

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性别: GG
专业: 植物遗传学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

如果原来的引物P不出来，我觉得可能是PCR产物发生了降解，我遇到过测序结果中找不到引物或者引物不全的情况，估计是在做连接前DNA两端降解的缘故。我一般连接完T载体，做菌落PCR时用T载的测序引物，也就是用载体序列设计引物，看产物大小是否正确，如果正确就去测序。这样也挺方便的，尤其是一次做很多不同连接的情况，省着分别加引物了。
如果降解的比较严重，那就重做一遍，从PCR开始。这个应该不是引物的问题，不需要重合引物。