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wsshforget

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr细菌基因组基因P不出来怎么回事,条件见帖子。

我将TET基因整合到细菌的基因组上,但是一直P不出来,抗生素筛选能选出来菌种,是不是因为变性时间不够吗?
我的体系是
buffer 2.5微升 (加有mg2+)
dntp        2
PF            1
PR            1
rtag          0.25
模版     挑取单菌落
ddH2O      18.25
总体积    25微升


PCR条件
94  5min
94  40s
52   30s
72   1min30s
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Milanmy

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果原来的引物P不出来,我觉得可能是PCR产物发生了降解,我遇到过测序结果中找不到引物或者引物不全的情况,估计是在做连接前DNA两端降解的缘故。我一般连接完T载体,做菌落PCR时用T载的测序引物,也就是用载体序列设计引物,看产物大小是否正确,如果正确就去测序。这样也挺方便的,尤其是一次做很多不同连接的情况,省着分别加引物了。
如果降解的比较严重,那就重做一遍,从PCR开始。这个应该不是引物的问题,不需要重合引物。
9楼2010-01-04 16:57:44
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spiderboy

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 12-31 21:13
是菌落PCR验证吗?
建议可以用菌液PCR。就是把你挑的单菌落培养几个小时,然后取3至5微升煮沸变性后,做模板,按正常的条件PCR即可。
估计是基因没有被整合进去的可能性比较大。
还有,楼主,你的dNTP用量有点多了,也可能会抑制酶活,取1微升就很足够了。
2楼2009-12-31 20:57:26
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主

变性时间该是够了

其他的不清楚,经验也不多
3楼2009-12-31 20:58:54
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你的目的是什么啊?
鉴定吗?
如果是,可以交给测序公司做吧,测个序就知道对不对啦。
生物资源交流QQ群:1044518333
4楼2009-12-31 21:37:59
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