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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】TA克隆求租
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】TA克隆求租

我做TA克隆，遇到以下问题，请高手指点：
1、蓝白筛选，全部是白斑（已经放在4度冰箱显色了），难道全部是重组子
2、有一个板一个菌都没有，都是一起的，为什么会一个菌都不长，浓度加大又涂了一次，还是一个都没长
3、PCR检测无论是菌落PCR还是放大后的菌液进行PCR都没有任何条带，就连载体片段都没有
4、invitrogen的盒子提供的GW1和GW2引物，没有提供退火温度，我使用了50、55、65，根据Primer5计算应该是65.8度


由于遇到以上问题，我对胶回收产物进行了检测，结果条带清晰可见，虽然并不是特别亮


不知道这种情况谁遇到过，如果质粒转化进感受态细胞的话，即使载体自连也会有质粒片段跑出来的，会不会是转化失败，这种情况会全部是白斑吗？但是考虑到转化是很简单的步骤，我怀疑不会失败，那PCR检测会不会有问题？
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1楼 2009-12-31 10:04:19
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wwyy0818

新虫 (小有名气)
请确认你的感受态没有问题
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2楼2009-12-31 10:20:49
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wwyy0818

新虫 (小有名气)
肯定是你的感受态出问题了
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3楼2009-12-31 10:21:35
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
yujiaping1(金币+4,VIP+0):我没有用IPTG，盒子中说不需要，抗生素用的是壮观霉素 1-1 18:19
1.确认你的感受态有没有问题
2.IPTG和x-gal有没有问题
3.抗生素有没有问题
4.外源片段的插入最好是提取质粒然后酶切验证这样比较保险，pcr一般假阳性比较多，我们从来不用pcr的方法验证。pcr验证结果不可靠
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4楼2009-12-31 11:07:55
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★ ★
yujiaping1(金币+2,VIP+0): 1-17 21:24
为什么不酶切检测? PCR很不可靠
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5楼2009-12-31 11:51:31
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
感受态出问题会长菌吗？会有白斑吗？
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6楼2010-01-01 18:21:08
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wwyy0818 at 2009-12-31 10:20:
请确认你的感受态没有问题

感受态出问题会有白斑吗？或者是载体没有进入感受态细胞？
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7楼2010-01-01 18:24:33
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wwyy0818

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
yujiaping1(金币+3,VIP+0): 1-15 12:30
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-1-1 18:24:

感受态出问题会有白斑吗？或者是载体没有进入感受态细胞？

前段时间我也遇到和你一样的问题，最后确定是感受态不行了
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2010-01-15 11:11:46
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sailormoon8623

感受态是否可用
是不是片段太大了？我们做过最长的是2.7kb，不是很好连，但是最终也会连进去
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9楼2010-01-15 11:15:25
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spring0304

木虫 (小有名气)
支持3楼看法
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10楼2010-01-16 21:19:48
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