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xiaochongzii

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】多重PCR的问题

我做的9对引物的多重PCR发现有的只有一条特异性条带,有的有3条条带,照说只出现1条条带是对的。为什么会出现这个情况啊?
10*buffer 5微升;25mM氯化镁 6.5微升;10mM的dNTPS 1微升;每条引物1微升;5u的Taq酶0.5微升;DNA模板1微升;总体系50微升。
条件:94° 3min;94° 30s;55°30s;72°45s;30cycles;72° 10min
恳求各位高手帮忙!!

另:我想把照片传上去,但是不知道怎么传啊
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

你说的单位应该是pmol/ul吧,和我说的是一样的,这样的浓度,建议你引物浓度加到2ul

还是没有明白你所说的特异性扩增,你的每一对引物都是为了扩增同一条带,还是怎么回事?据我所知,多重PCR是没对引物都是扩增一个位点,每个引物的位点距离应该有差异,这样可以一起PCR,然后获得的条带因为大小有差异,电泳的时候会自然分开,不影响彼此,当然也是特异性扩增
5楼2009-12-21 21:05:01
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spiderboy

金虫 (正式写手)


xiaochongzii(金币+1,VIP+0):谢谢,我也希望同你交流一下,我加你为好友吧 12-20 23:00
照片可以先发到一些公共网站上,然后链接过来。。。即可。。。
楼主,为什么只有一条条带是对的?难道是9对引物扩出来的片段都一样大?
出现3条带,我认为是非特异性的扩增出现了,因为你的镁离子浓度有点高了,退火温度差不多。。。。我有做16重的,不过最多就扩出15重,不好做,。。也在想办法。。我们可以交流下
2楼2009-12-20 22:49:08
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


xiaochongzii(金币+1,VIP+0): 12-21 20:54
如楼上所说,镁离子浓度太高了,我建议镁离子加3ul就可以了,如果效果不好4ul最大量,不能再多了。另外引物浓度是10uM吗?如果是,引物浓度可有点低了。还有如楼上所说,9对引物,应该是至少9条带啊,为什么是1条,不明白楼主是不是在做多重PCR,奇怪。
3楼2009-12-21 20:34:12
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xiaochongzii

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-21 20:34:
如楼上所说,镁离子浓度太高了,我建议镁离子加3ul就可以了,如果效果不好4ul最大量,不能再多了。另外引物浓度是10uM吗?如果是,引物浓度可有点低了。还有如楼上所说,9对引物,应该是至少9条带啊,为什么是1条 ...

我的引物浓度时10pM的。我做的是特异性扩增的
4楼2009-12-21 20:57:38
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