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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】多重PCR的问题
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xiaochongzii

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】多重PCR的问题

我做的9对引物的多重PCR发现有的只有一条特异性条带，有的有3条条带，照说只出现1条条带是对的。为什么会出现这个情况啊？
10*buffer 5微升；25mM氯化镁 6.5微升；10mM的dNTPS 1微升；每条引物1微升；5u的Taq酶0.5微升；DNA模板1微升；总体系50微升。
条件：94° 3min；94° 30s；55°30s；72°45s；30cycles；72° 10min
恳求各位高手帮忙！！

另：我想把照片传上去，但是不知道怎么传啊
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1楼 2009-12-20 21:44:58
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
xiaochongzii(金币+1,VIP+0):谢谢，我也希望同你交流一下，我加你为好友吧 12-20 23:00
照片可以先发到一些公共网站上，然后链接过来。。。即可。。。
楼主，为什么只有一条条带是对的？难道是9对引物扩出来的片段都一样大？
出现3条带，我认为是非特异性的扩增出现了，因为你的镁离子浓度有点高了，退火温度差不多。。。。我有做16重的，不过最多就扩出15重，不好做，。。也在想办法。。我们可以交流下
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2楼2009-12-20 22:49:08
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
xiaochongzii(金币+1,VIP+0): 12-21 20:54
如楼上所说，镁离子浓度太高了，我建议镁离子加3ul就可以了，如果效果不好4ul最大量，不能再多了。另外引物浓度是10uM吗？如果是，引物浓度可有点低了。还有如楼上所说，9对引物，应该是至少9条带啊，为什么是1条，不明白楼主是不是在做多重PCR，奇怪。
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3楼2009-12-21 20:34:12
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xiaochongzii

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-21 20:34:
如楼上所说，镁离子浓度太高了，我建议镁离子加3ul就可以了，如果效果不好4ul最大量，不能再多了。另外引物浓度是10uM吗？如果是，引物浓度可有点低了。还有如楼上所说，9对引物，应该是至少9条带啊，为什么是1条 ...

我的引物浓度时10pM的。我做的是特异性扩增的
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4楼2009-12-21 20:57:38
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
你说的单位应该是pmol/ul吧，和我说的是一样的，这样的浓度，建议你引物浓度加到2ul

还是没有明白你所说的特异性扩增，你的每一对引物都是为了扩增同一条带，还是怎么回事？据我所知，多重PCR是没对引物都是扩增一个位点，每个引物的位点距离应该有差异，这样可以一起PCR，然后获得的条带因为大小有差异，电泳的时候会自然分开，不影响彼此，当然也是特异性扩增
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5楼2009-12-21 21:05:01
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LYZX

捐助贵宾 (初入文坛)
★
xiaochongzii(金币+1,VIP+0): 12-22 22:20
建议楼主把引物对数减少，褪火温度可以控制的更精确，减少非特异性扩增，出现了其他条带，应该影响不大，按照引物设计的数据选择正确的条带纯化就是了。
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创造一个奇迹
6楼2009-12-22 15:03:31
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