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安静的位置i金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】急！关于孢子萌发。
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我的课题是与真菌相关，目前在培养一种被孢霉，前段时间，冲孢子后涂布ＰＤＡ平板，28度静置培养，萌发率大约为百分之一，孢子液稀释两个梯度后，一块板大约可以长出几百个菌落，从一个月前开始，在操作和培养条件都没有变的情况下，孢子突然不萌发了，涂过板子后一个都不会长或是偶尔长一两个菌落，这次将原始菌种活化，冲了孢子后涂板，还是不萌发。 目前课题因为这个原因处在停滞阶段，非常着急，了解真菌的兄弟姐妹们，快给我些建议吧，万分感谢！！！ |
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安静的位置i(金币+8,VIP+0): 12-31 14:22
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你的这个霉菌我没做过，但是做过很多其它的真菌，从我的角度来问你几个问题： 1、我的课题是与真菌相关，目前在培养一种被孢霉，前段时间，冲孢子后涂布ＰＤＡ平板，28度静置培养，萌发率大约为百分之一 萌发率怎么计算？是首先在显微镜下数孢子浓度后涂板，实际生长菌落除以总孢子数吗？孢子液有没有过滤除去菌丝？菌丝也能萌发生长成菌落的。 2、孢子液稀释两个梯度后 稀释多少倍为一个稀释梯度？ 3、一块板大约可以长出几百个菌落 真菌菌落长得较大才能看得出一些菌落形态，这个菌落数太大了，菌落还没生长成可鉴别的形态，怎么知道长的就是你的菌？不能排除被污染的情况。我的很多真菌在生长初期都是白色的菌丝，一块直径9厘米的平板上如果要求是独立菌落以排除太密长成菌苔造成不能鉴别是多少个菌落合并而成的话，最多只能长50个！你的平板很大？ 4、从一个月前开始，在操作和培养条件都没有变的情况下，孢子突然不萌发了，涂过板子后一个都不会长或是偶尔长一两个菌落 孢子液没有保存好的话一样会死掉，时间越久死得越多。 5、这次将原始菌种活化，冲了孢子后涂板 如果是生长时间不够，孢子长得不多，冲也冲不下去多少。我是直接用牙签刮到水里，震荡后过滤。 |
2楼2009-12-20 01:32:13
3楼2009-12-20 08:51:42
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你好！很高兴能碰到对真菌这么了解的高人。 1.萌发率就是想你所说，先是镜检计数，然后再根据涂布后的菌落数计数计算。我的孢子液是这样得到的，首先是用斜面管 培养至少两周时间，然后用0.03%吐温水溶液冲孢子，之后过滤布和20微米的滤膜，去除菌丝及其他杂质，然后离心12000rpm,10min,去除上清，用0.03%吐温水溶液清洗孢子，重复以上两个步骤两次，之后就是稀释涂板。 2. 一个稀释梯度就是稀释十倍。 3. 板子上最多长过约200个菌落，我一般不会等到它长成圆形白色较大菌落时再计数，因为那时菌落就都已经连成片了，我一般在有“菌斑”形成时计数，不知你的菌是否也是这样，就是萌发的最初阶段，它会形成半透明状态的圆形边缘不光滑的“菌斑”，直径在1-10mm，这是在对着灯光看时，是可以看清楚的， 4. 孢子液都是现用现涂板，没有将其置于冰箱中存放。 5.所有冲 孢子的斜面管都是在培养了至少两周后使用的。您是培养在平板上然后用牙签刮取的吧？不过我冲孢子后没有振荡这一步，只是用移液器洗吹，不过这步应该不是孢子不萌发的关键吧。 非常感谢你对我问题的解答，希望能为我提供些好的建议！非常感谢！也可站内信联系：） |
4楼2009-12-20 15:58:17
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5楼2009-12-20 20:00:39
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6楼2009-12-20 23:28:59
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7楼2009-12-20 23:31:52
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8楼2009-12-21 11:12:04
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1、没必要用“您”这个尊称，大家交流而已。 2、关于吐温 有几种不同的吐温，分子式和性质都不同的，不知道是不是吐温的因素。 促进孢子萌发的使用浓度也有人做过梯度，不知道你有没有做过。 促进孢子萌发的用法，最后稀释是不是也是用吐温的水溶液。 3、离心取孢子是真菌诱变里常用的技术（很简单的操作，不一定合适称为技术），真菌的孢子从大小和形状都有不同的，比如草酸青霉的孢子就比枝状枝孢霉和里氏木霉的大（本实验室观察结果），一万两千转离心10分钟不一定合适。我做NTG诱变的时候做过离心转速和时间对孢子沉降效果的梯度预备试验，建议重新考虑转速和时间的问题。不过NTG诱变没有继续做下去，实验方向有改变，所以做诱变我只是浅尝即止而已。 4、以10倍为稀释梯度跨度太大，我喜欢用5倍，每个稀释梯度涂布3块平板，重复程度很好。 5、每块平板（直径9厘米）生长15-25个真菌菌落是我最喜欢的计数梯度，而且我喜欢等到真菌长出孢子之后才计数，确认生长出来的菌落是我想要的菌落。大多数真菌，比如说黑曲霉和米曲霉菌落形态差别极大，但是在一天多一点的时候生长形态都是白色的菌丝，也就是你所说的对着光就能看到的那种形态，是不能辨别种类的，只有两天之后产生孢子之后菌落形态才有差异，才能计数。所以建议你从稀释梯度、涂板选用的梯度和计数时间都思考一下。 6、菌落直径1-10mm差异很大，说明有些菌落靠得很近，生长受限制，这种稀释梯度太密集，建议使用更大的稀释梯度。 7、孢子液现用现做，不存在孢子液存放在四度冰箱里时间过久造成孢子死亡的问题，但是值得注意的是菌落上的孢子也是随着时间的推移，生活力会下降。草酸青霉培养两天后菌落开始产孢子，5天后孢子就很多了，应该收获了，但是培养更久的话孢子生活力会下降。嗜松青霉产孢子较晚，4天后才产，就更应该注意了。你的真菌养半个月算是很久的了，不过如果有必要养那么久的话就另当别论了。 8、移液器洗吹对孢子的打散效果我不知道，我只喜欢野蛮手段而已：玻璃珠加摇床，必要时用手猛抖，抖它个七荤八素的效果就很好了。 你的真菌我没做过，我也没有制作孢子液要培养半个月那么久的真菌，我的真菌们长孢子最晚也就只有嗜松青霉而已，也只用一周到十天。至于萌发率的问题，我能想到的暂时也就这么多而已了，不一定能给你帮助。 |
9楼2009-12-21 13:47:04
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10楼2009-12-21 13:48:45