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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 【求助/交流】6碱基的低频内切酶和4碱基高频内切酶酶切条件之差异？
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yf-deng

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】6碱基的低频内切酶和4碱基高频内切酶酶切条件之差异？

要疯了，做AFLP选则6碱基的低频内切酶(HindIII-A/AGCTT，EcoRI-GAATT/C，PstI-CTGCA/G)老是切不动（至少无明显的酶切迹象），
而4碱基的高频内切酶（TaqI-T/CGA，MseI-T/TAA）则能切的很好，不知道大家有何高见？难道是6碱基低频内切酶对DNA的质量要求非常高（杂质污染要求高）？
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1楼 2009-12-16 09:21:11
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yf-deng

金虫 (正式写手)
这是另一个酶切结果
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2楼2009-12-16 09:21:46
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pal2004

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
对呀，你的DNA很可能完整度不好。
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3楼2009-12-16 09:53:44
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yf-deng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pal2004 at 2009-12-16 09:53:
对呀，你的DNA很可能完整度不好。

何以见得呢？谢谢您的回复！
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4楼2009-12-16 10:31:01
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yf-deng

金虫 (正式写手)
请大家指教！
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5楼2009-12-18 09:39:32
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pal2004

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
理论上，4碱基识别位点在基因组中出现的概率是6碱基识别位点的16倍，也就是说，如果DNA完整度不好，各DNA片段中出现4碱基识别位点的概率比6碱基出现的概率大至少一个数量级。所以有可能DNA片段中已没有你用的6碱基酶的完整识别位点了，4碱基识别位点可能还在。
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6楼2009-12-18 09:45:49
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yf-deng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pal2004 at 2009-12-18 09:45:
理论上，4碱基识别位点在基因组中出现的概率是6碱基识别位点的16倍，也就是说，如果DNA完整度不好，各DNA片段中出现4碱基识别位点的概率比6碱基出现的概率大至少一个数量级。所以有可能DNA片段中已没有你用的6碱基 ...

谢谢pal2004站友！您的意思是说有可能是我的DNA质量不高，导致6碱基的酶切位点无法识别了吗？从图上看我的DNA应该还可以呀！真要崩溃了！
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7楼2009-12-19 11:27:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一位网上的战友遇到的问题和你一样，我做过很长时间的AFLP，但是从没有将其中每个酶进行单独酶切，在我看来，实际情况可能是酶切的结果就是这样，因为那位战友没有解决这个问题，后来AFLP做出来了，所以建议你检测双酶切结果就可以了。稀有酶切位点的酶切结果可能就是这样的。建议你选择高品种的内切酶，最好是进口原装，我以前没做出来的时候就是因为用的国产酶，没有任何其他原因
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8楼2009-12-21 21:27:14
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yf-deng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-21 21:27:
一位网上的战友遇到的问题和你一样，我做过很长时间的AFLP，但是从没有将其中每个酶进行单独酶切，在我看来，实际情况可能是酶切的结果就是这样，因为那位战友没有解决这个问题，后来AFLP做出来了，所以建议你检测 ...

谢谢！请问您做AFLP是用什么酶切组合?还有您连接的时候一定量的体系分别用了多少接头？还有就是您在做预扩的时候两种预扩引物是否用的等量（因为我在做预扩的时候老是出现一条特异性的带）？如果不是，是怎样一个比值呢？谢谢！
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9楼2009-12-21 22:19:26
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yf-deng

金虫 (正式写手)
大家好，这是我今天的预扩结果，分别是,EcoRI 1ul/MseI 10ul预扩,EcoRI 1ul/TaqI 10ul预扩,EcoRI单酶切（4ul）预扩,MseI（10ul）单酶切预扩,TaqI（10ul）单酶切预扩结果，相对以前的结果就是没有明显的特异性带，难道是因为引物浓度的原因？

[ Last edited by yf-deng on 2009-12-21 at 22:35 ]
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10楼2009-12-21 22:28:31
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