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yf-deng

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】6碱基的低频内切酶和4碱基高频内切酶酶切条件之差异?

要疯了,做AFLP选则6碱基的低频内切酶(HindIII-A/AGCTT,EcoRI-GAATT/C,PstI-CTGCA/G)老是切不动(至少无明显的酶切迹象),
而4碱基的高频内切酶(TaqI-T/CGA,MseI-T/TAA)则能切的很好,不知道大家有何高见?难道是6碱基低频内切酶对DNA的质量要求非常高(杂质污染要求高)?
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yf-deng

金虫 (正式写手)

这是另一个酶切结果
2楼2009-12-16 09:21:46
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pal2004

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
对呀,你的DNA很可能完整度不好。
3楼2009-12-16 09:53:44
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yf-deng

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by pal2004 at 2009-12-16 09:53:
对呀,你的DNA很可能完整度不好。

何以见得呢?谢谢您的回复!
4楼2009-12-16 10:31:01
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yf-deng

金虫 (正式写手)

请大家指教!
5楼2009-12-18 09:39:32
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pal2004

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
理论上,4碱基识别位点在基因组中出现的概率是6碱基识别位点的16倍,也就是说,如果DNA完整度不好,各DNA片段中出现4碱基识别位点的概率比6碱基出现的概率大至少一个数量级。所以有可能DNA片段中已没有你用的6碱基酶的完整识别位点了,4碱基识别位点可能还在。
6楼2009-12-18 09:45:49
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yf-deng

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by pal2004 at 2009-12-18 09:45:
理论上,4碱基识别位点在基因组中出现的概率是6碱基识别位点的16倍,也就是说,如果DNA完整度不好,各DNA片段中出现4碱基识别位点的概率比6碱基出现的概率大至少一个数量级。所以有可能DNA片段中已没有你用的6碱基 ...

谢谢pal2004站友!您的意思是说有可能是我的DNA质量不高,导致6碱基的酶切位点无法识别了吗?从图上看我的DNA应该还可以呀!真要崩溃了!
7楼2009-12-19 11:27:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
一位网上的战友遇到的问题和你一样,我做过很长时间的AFLP,但是从没有将其中每个酶进行单独酶切,在我看来,实际情况可能是酶切的结果就是这样,因为那位战友没有解决这个问题,后来AFLP做出来了,所以建议你检测双酶切结果就可以了。稀有酶切位点的酶切结果可能就是这样的。建议你选择高品种的内切酶,最好是进口原装,我以前没做出来的时候就是因为用的国产酶,没有任何其他原因
8楼2009-12-21 21:27:14
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yf-deng

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-21 21:27:
一位网上的战友遇到的问题和你一样,我做过很长时间的AFLP,但是从没有将其中每个酶进行单独酶切,在我看来,实际情况可能是酶切的结果就是这样,因为那位战友没有解决这个问题,后来AFLP做出来了,所以建议你检测 ...

谢谢!请问您做AFLP是用什么酶切组合?还有您连接的时候一定量的体系分别用了多少接头?还有就是您在做预扩的时候两种预扩引物是否用的等量(因为我在做预扩的时候老是出现一条特异性的带)?如果不是,是怎样一个比值呢?谢谢!
9楼2009-12-21 22:19:26
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yf-deng

金虫 (正式写手)

大家好,这是我今天的预扩结果,分别是,EcoRI 1ul/MseI 10ul预扩,EcoRI 1ul/TaqI 10ul预扩,EcoRI单酶切(4ul)预扩,MseI(10ul)单酶切预扩,TaqI(10ul)单酶切预扩结果,相对以前的结果就是没有明显的特异性带,难道是因为引物浓度的原因?

[ Last edited by yf-deng on 2009-12-21 at 22:35 ]
10楼2009-12-21 22:28:31
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