应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】细胞凋亡形态学观察 细胞爬片
141/2返回列表12下一页
查看: 1364  |  回复: 13
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

richenim

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】细胞凋亡形态学观察 细胞爬片

我最近在做细胞形体学染色观察，可是出现了些问题哦。希望高手能帮忙解决下哦
我是这样操作的：
1，将玻片置于六孔板，接种细胞               
2，给药，24h后洗尽培养基，PBS洗2遍，加入2ml 3.7% 多聚甲醛固 定10min
3，弃去固定液，PBS洗3遍，每次3min，洗尽液体
4，加入1ml（10微克/ml）hoechest33342，37度培养15min
PS: hoechest33342是用蒸馏水先配成1mg/ml，再用PBS稀释成10微克/ml后加入的。
有很多问题出现了：首先第一步中，接种细胞16小时后细胞在玻片上的贴壁效果不好，很多还是漂浮着。而且玻片下面不知怎么出现很多气泡，是不是我细胞爬片没做好，还是接种的细胞密度太大，还是其他什么原因。
第二步中，细胞固定10min后用PBS洗涤后感觉细胞没有完全固定，还是有漂浮的，不知道是不是固定的时间短了。最后加荧光染料，染色15min后，荧光显微镜观察荧光的强度很弱，我在想加入荧光染料染色后需不需要将液体弃去再观察？

我的操作步骤有没有问题啊？

做细胞凋亡形态学观察可不可以不用做细胞爬片，直接在板里接种，给药，荧光染料染色后观察啊？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼2009-12-13 16:24:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

richenim

金虫 (小有名气)
怎么都没人来帮忙解答一下哦！
赞一下 回复此楼
2楼2009-12-15 14:00:05
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小神300

新虫 (初入文坛)
★ ★
richenim(金币+2,VIP+0): 12-15 21:56
我也有做过细胞凋亡，就自己的经验说点，希望对你有所帮助
1、细胞贴壁不好可能也和细胞状态有关吧，还有，爬片没弄好，确实会在下面有气泡，不过，这个我觉得影响不是很大，我也碰到过这种情况，对最终结果影响不是很大。
2、细胞固定的话，我一般都是30min--60min的，有漂浮的话是避免不了的，因为加药之后细胞状态不好，贴壁不牢了，而且，细胞固定也不是说固定在爬片上的意思吧。
3、还有，你的hochest33342买来是粉末的吗？我看资料一般的荧光染料都不是用水来配置成高浓度的，好像是DMSO之类的吧，具体也不是很清楚
4、染色好了之后，PBS洗后，我一般都加80%甘油（PBS配制），不会让片子干着的
5、不知道你是用什么显微镜来观察荧光了，如果是倒置的荧光显微镜的话，你如果爬片做好了之后放在板里或者如你所说不做细胞爬片直接在板里进行的话，看的不是很清楚的，因为我们用的六孔板底部太厚了，不适合观察，可能低倍镜还看到，高倍镜下应该就看不到了的。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2009-12-15 18:25:10
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzhwin

木虫 (正式写手)
★
richenim(金币+1,VIP+0): 12-15 21:45
仅用honchest就可以鉴定凋亡吗？是不是应该再做个TUNEL或者landder或者磷脂酰丝氨酸之类的鉴定。honchest不好可以试试DAPI，浓度和时间也要摸索一下都不是万能的。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2009-12-15 19:22:00
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

apple-z

银虫 (小有名气)
★
richenim(金币+1,VIP+0): 12-15 22:07
觉得固定效果不好，可以在去除固定液后将带有细胞的片子晾一晾，干了之后再加其他液体，这样就可以缓解细胞漂浮的状况了。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2009-12-15 19:44:04
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2009-12-15 19:22:
仅用honchest就可以鉴定凋亡吗？是不是应该再做个TUNEL或者landder或者磷脂酰丝氨酸之类的鉴定。honchest不好可以试试DAPI，浓度和时间也要摸索一下都不是万能的。

浓度和时间已经摸索好了，现在就是用honchest先观察下形态学，也不是不好，我觉得是我在操作中有些问题，细胞爬片的效果很差，还有就是最后加了荧光染料后在荧光显微镜下的荧光强度很弱。
赞一下 回复此楼
6楼2009-12-15 21:49:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小神300

新虫 (初入文坛)
★
richenim(金币+1,VIP+0): 12-15 22:09
不知道你是不是用激光共聚焦显微镜观察，
有专门特质的小平皿，它的底部是很薄的玻璃，用这个的话就不用细胞爬片了，这种小皿可以直接在显微镜下观察的
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2009-12-15 21:57:16
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小神300 at 2009-12-15 18:25:
我也有做过细胞凋亡，就自己的经验说点，希望对你有所帮助
1、细胞贴壁不好可能也和细胞状态有关吧，还有，爬片没弄好，确实会在下面有气泡，不过，这个我觉得影响不是很大，我也碰到过这种情况，对最终结果影响 ...

（1）其实是将细胞接种在破片上的时候就有大量的细胞不贴壁（我加了1ml的培养液，孵育了16h后）。我也不知道是为什么，细胞的数量也还可以，但就是不贴在玻片上。
（2）hochest33342是粉末的，我查的资料是先用水或者PBS配制成1mg/ml的。
（3）我用的是倒置荧光显微镜。用的是10陪的物镜，电脑上照出来的效果很不好，就连目镜里面看的荧光也很弱哦。

我现在就是没有在六孔板里面放玻片了，直接接种在六孔板里，给药，也不固定，直接加染料，现在还在做的过程中，也不知道结果怎么样。也不知道这种方法行不行哦。
赞一下 回复此楼
8楼2009-12-15 22:05:47
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

richenim

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小神300 at 2009-12-15 21:57:
不知道你是不是用激光共聚焦显微镜观察，
有专门特质的小平皿，它的底部是很薄的玻璃，用这个的话就不用细胞爬片了，这种小皿可以直接在显微镜下观察的

我用的是倒置荧光显微镜哦，可不可以不爬片，直接在六孔板里做哦？
赞一下 回复此楼
9楼2009-12-15 22:10:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
richenim(金币+3,VIP+0): 12-16 00:05
1、直接种板不需爬片
2、尝试37度固定15min
3、每次PBS洗都不要冲，对着边缘的壁流下去覆盖孔，然后直接吸走，不需太长时间，洗两次足够
4、尝试37度染20~30min，如果着色很浅，33342是比较难染一些的
5、染完hoechst要吸掉，用PBS洗一两次，然后加一点PBS到孔里（防止干掉），观察。把盖子打开观察。注意避光。可用高像素的低倍镜拍摄后放大观察。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2009-12-15 23:10:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 richenim 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭