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G418筛选稳定表达细胞系 1.G418的配制： 方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um 过滤，-20℃保存。 方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。 （2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。 注：实验中采用方案二时效果较好。 2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml 24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。 200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml 800 ug/ml 900 ug/ml 1000 ug/ml 1100 ug/ml 1200 ug/ml 3ml完全培养基 998.4 997.6 996.8 996 995.2 994.4 993.6 992.8 992 991.2 990.4 G418(500mg/ml) 1.6ul 2.4ul 3.2ul 4.0ul 4.8ul 5.6ul 6.4ul 7.2ul 8.0ul 8.8ul 9.6ul 3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（20000/孔），12h换液，加筛选培养基培养。 4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。 注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。 5.铺6孔板（20万/孔），第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。 注意：细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果（G418很难发挥作用）。 6.在换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。 7.培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即6中所配制。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。 8.培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。 9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。 10.挑单克隆：高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。 ●套环法：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。 ●刮除法：刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。 11.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，①提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达 ②western检测目的基因。 注意：转染时压系时细胞不能铺的太满，不然当细胞连接紧密后，压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。 |
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