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刘仕博金虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】被 real time-PCR折磨的孩子又来提问~
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不好意思又来麻烦大家，不过还是厚着脸皮发个小贴~ 最近我买了新的引物。像之前哪位高手建议过的，我先做了次PCR，觉得引物没有问题，就直接用real time-PCR做了primer test。 什么都可以就是扩增效率不够，在70-80%。引物的Tm值在64度左右，所以我设置的退火温度是58度。 如果想提高扩增效率我该怎么做呢？增加模板的浓度？改变退火温度？ 感激不尽！ |
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2楼2009-12-10 12:57:05
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4楼2009-12-10 13:59:04
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5楼2009-12-10 17:06:03
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8楼2009-12-11 12:21:31
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一不小心我的帖子咋被置顶了呢~ 那我就把我每天的实验心得写在这里吧，给其他像我一样对PCR没有什么常识的朋友们一些参考。 之前我增加了模板的浓度，结果还是不理想。而且我发现浓度太高反而会影响结果，所以浓度的问题被排除了。 之后又被我师姐误导，说退火温度得和引物的Tm温度一致，我也试着做了，结果证明那个是错误的。而且我发现出来的结果比之前的还不好，扩增效率反而降低了，而且引物的特异性也有所变化。 而且我还发现了一个问题，就是Ct值的问题。其实我对那个值一直没有什么研究，只知道拿它能算出结果。后来发现这个值好像也能说明一些扩增效率的问题，就大概差了下。据说Ct值一般不能大于30。然后我又看了下自己的数据，也发现了点有意思的事情。同样是58度5倍稀释做primer test，一个引物的两条链的Tm值为62.1度和60.8度，最后的Ct值为22.15-30.02。另一个引物的两条链的Tm值为62.7度和63.1度，最后的Ct值为20.23-32.05.现在这个能说明什么事情我还弄不太懂，不过我在研究，呵呵~ 后来又向高手请教，据说退火温度要比引物中Tm较低的那个温度低5度，我明天打算试一下。 |
9楼2009-12-12 00:58:03
刘仕博
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现在已经是北京时间1点了，韩国时间2点。 不过刚刚又有了新的想法，所以来和大家分享下，可能是些比较肤浅的东西，但也许会对一些人有点小启示吧~ 我的那点破事相信经常来这里逛的虫子们都已经知道了，可能都已经让我给烦死了。首先和大家报告下我的实验情况。周六的时候又去实验室把一直折磨我的这个破引物按温度梯度全部real time了一遍，未果。周六的时候一般做着实验一遍在网上搜索所有的信息，有个小收获，那就是如果做real time,就最好用real time来优化条件，一般PCR可能是便宜些，但结果不能用到real time上面，这也是我做了几次试验总结出来的经验。 不过因为实验没有结果，周日就出去逛街了。 刚刚在洗澡的时候忽然想通了件事情。之前大家天天在说引物本身的二级结构和引物间的二级结构。之前我师姐在和我说找引物的规则的时候只提到了引物本身的二级结构，所有我对后者一直没有什么概念，也就没注意过那个。刚刚忽然间自己就想通了，可能我试验失败也是因为那个造成的吧，打算明天回去看下。 在这里说这个不是为了给大家普及什么引物二级结构的知识，估计大家比我知道的多的多。我只是想说，遇到什么问题的时候除了郁闷之外多想想怎么解决它，而且别放过任何一个盲点。祝我明天的实验成功，呵呵~ 对了，今天出去拍了点韩国圣诞前大街的照片放在QQ空间里面了，大家实验郁闷的时候可以去扫两眼。因为不是什么美女，所以别对人做什么评价，谢谢~ 我的QQ：289945429 [ Last edited by 刘仕博 on 2009-12-14 at 01:09 ] |
10楼2009-12-13 22:49:07