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刘仕博

金虫 (著名写手)

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性别: MM
专业: 环境工程

[交流] 【求助/交流】被 real time-PCR折磨的孩子又来提问~

不好意思又来麻烦大家，不过还是厚着脸皮发个小贴~
最近我买了新的引物。像之前哪位高手建议过的，我先做了次PCR，觉得引物没有问题，就直接用real time-PCR做了primer test。
什么都可以就是扩增效率不够，在70-80%。引物的Tm值在64度左右，所以我设置的退火温度是58度。
如果想提高扩增效率我该怎么做呢？增加模板的浓度？改变退火温度？
感激不尽！

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生命在于折腾~

1楼2009-12-10 10:52:05

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刘仕博

金虫 (著名写手)

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amisking(金币+5,VIP+0):鼓励一下！ 12-12 15:33

一不小心我的帖子咋被置顶了呢~
那我就把我每天的实验心得写在这里吧，给其他像我一样对PCR没有什么常识的朋友们一些参考。
之前我增加了模板的浓度，结果还是不理想。而且我发现浓度太高反而会影响结果，所以浓度的问题被排除了。
之后又被我师姐误导，说退火温度得和引物的Tm温度一致，我也试着做了，结果证明那个是错误的。而且我发现出来的结果比之前的还不好，扩增效率反而降低了，而且引物的特异性也有所变化。
而且我还发现了一个问题，就是Ct值的问题。其实我对那个值一直没有什么研究，只知道拿它能算出结果。后来发现这个值好像也能说明一些扩增效率的问题，就大概差了下。据说Ct值一般不能大于30。然后我又看了下自己的数据，也发现了点有意思的事情。同样是58度5倍稀释做primer test，一个引物的两条链的Tm值为62.1度和60.8度，最后的Ct值为22.15-30.02。另一个引物的两条链的Tm值为62.7度和63.1度，最后的Ct值为20.23-32.05.现在这个能说明什么事情我还弄不太懂，不过我在研究，呵呵~
后来又向高手请教，据说退火温度要比引物中Tm较低的那个温度低5度，我明天打算试一下。