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刘仕博

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】被 real time-PCR折磨的孩子又来提问~

不好意思又来麻烦大家,不过还是厚着脸皮发个小贴~
最近我买了新的引物。像之前哪位高手建议过的,我先做了次PCR,觉得引物没有问题,就直接用real time-PCR做了primer test。
什么都可以就是扩增效率不够,在70-80%。引物的Tm值在64度左右,所以我设置的退火温度是58度。
如果想提高扩增效率我该怎么做呢?增加模板的浓度?改变退火温度?
感激不尽!
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生命在于折腾~
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刘仕博

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 六妖妖 at 2009-12-11 12:09:
10倍稀释的时候Ct值是否满足在3.32左右。如果满足,模板是否降解,可加大模板量。如果模板没有降解,还是引物的问题。

我是5倍稀释的,Ct值在27左右
据说温度不行,我的primer的温度是63度左右,之前在设计退火温度的时候我按照一般PCR的规则把温度设置为58度,可能这样是不对的吧。我又把温度调到了62度。。。
期待好的结果~
生命在于折腾~
8楼2009-12-11 12:21:31
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刘仕博

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by j2 at 2009-12-10 12:57:
增加循环数

先谢啦~
不过我已经设置到44个循环了,估计也不能再多了。
我增加了模板的浓度,不知道能不能 行~
生命在于折腾~
3楼2009-12-10 13:11:30
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qqsvery

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 12-11 12:31
是不是荧光探针的问题呢?各引物的浓度与探针的浓度比例等等。。。
谎言和真实在河边洗澡,谎言先洗好,穿走了真实的衣服,真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言,却很难接受赤裸裸的真实。
4楼2009-12-10 13:59:04
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刘仕博

金虫 (著名写手)

我试了几个浓度了,还是不行。
我师姐说是我的模板不行,据说引物找的也不太好,不过我个人觉得引物还是可以用的。我打算从cDNA开始重新弄~
生命在于折腾~
5楼2009-12-10 17:06:03
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