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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教：PCR引物设计几点问题
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 请教：PCR引物设计几点问题

最近在学习PCR引物设计，向各位请教以下几点问题：
1、对于引入的酶切位点有什么要求吗？
2、对于已知序列的扩增，设计的引物是不是必须要位于目的基因的两侧？
感谢各位高手指点迷津，小女子不胜感激。
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
1楼 2009-12-05 16:04:36
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竹子2225

银虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:06
你加入的酶切位点应该是你要连接的载体上有的，并且在你的目的基因中不包含的
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2楼2009-12-05 17:02:41
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695

木虫 (职业作家)
★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:07
第二个问题要看你扩增的目的了，若是扩全长的话，当然位于两端最好了，要是扩其中某部分，你得自己合计着了
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3楼2009-12-05 17:06:21
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:07
补充一下楼上的两位，引入的酶切位点最好是年末端的限制性内切酶，且要加入保护碱基。
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4楼2009-12-05 17:20:24
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 12-5 18:32
bettyshan(金币+3,VIP+0): 12-6 23:08
引入的酶切位点要是你基因内部没有的，酶切位点肯定在你的基因的两端，这样你才能得到全长的完整的基因。如果你后面要酶切连接的话，可以直接加入保护碱基，可以进行pcr产物的直接酶切。保护碱基可以参考neb的说明书，那个上面有详细的说明，比较难酶切的位点添加的饱和碱基要多一些。酶切位点还要看你以后弄的载体，以后的载体有的，而且比较常见的，这样可以降低成本，常用酶便宜些。
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5楼2009-12-05 18:06:35
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习学习！
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6楼2009-12-05 18:52:03
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shuiyue2728

新虫 (正式写手)
位于目的基因两侧？
是一个上游引物，一个下游引物吧
若要全长，克隆出来测序后再用RACE
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7楼2009-12-05 23:43:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-14 21:40
补充下，千万不要选择两个同尾酶，等构建好表达载体，发现连反，就只能泪奔了。
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Thank-you，so-blue.
8楼2009-12-06 13:27:49
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