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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 请教:PCR引物设计几点问题

最近在学习PCR引物设计,向各位请教以下几点问题:
1、对于引入的酶切位点有什么要求吗?
2、对于已知序列的扩增,设计的引物是不是必须要位于目的基因的两侧?
感谢各位高手指点迷津,小女子不胜感激。
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我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
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竹子2225

银虫 (小有名气)

★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:06
你加入的酶切位点应该是你要连接的载体上有的,并且在你的目的基因中不包含的
2楼2009-12-05 17:02:41
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695

木虫 (职业作家)

★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:07
第二个问题要看你扩增的目的了,若是扩全长的话,当然位于两端最好了,要是扩其中某部分,你得自己合计着了
3楼2009-12-05 17:06:21
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changes

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-5 17:37
bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-6 23:07
补充一下楼上的两位,引入的酶切位点最好是年末端的限制性内切酶,且要加入保护碱基。
4楼2009-12-05 17:20:24
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tianpingpe

新虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 12-5 18:32
bettyshan(金币+3,VIP+0): 12-6 23:08
引入的酶切位点要是你基因内部没有的,酶切位点肯定在你的基因的两端,这样你才能得到全长的完整的基因。如果你后面要酶切连接的话,可以直接加入保护碱基,可以进行pcr产物的直接酶切。保护碱基可以参考neb的说明书,那个上面有详细的说明,比较难酶切的位点添加的饱和碱基要多一些。酶切位点还要看你以后弄的载体,以后的载体有的,而且比较常见的,这样可以降低成本,常用酶便宜些。
5楼2009-12-05 18:06:35
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xuezhen

银虫 (小有名气)

学习学习!
6楼2009-12-05 18:52:03
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shuiyue2728

新虫 (正式写手)

位于目的基因两侧?
是一个上游引物,一个下游引物吧
若要全长,克隆出来测序后再用RACE
7楼2009-12-05 23:43:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


bettyshan(金币+1,VIP+0): 12-14 21:40
补充下,千万不要选择两个同尾酶,等构建好表达载体,发现连反,就只能泪奔了。
Thank-you,so-blue.
8楼2009-12-06 13:27:49
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