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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白表达求助
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白表达求助

我最近一段时间表达一个蛋白，怀疑这个蛋白有毒性(这个蛋白预想有切割活性)，目前试了PET30a,pGEX-4T-1载体和大肠杆菌BL21DE3,rosetta表达株，在加完IPTG后宿主都出现生长抑制现象，不过十几小时之后又生长了，但SDS电泳都没看出条带，使用了25℃的低温，也做了IPTG的浓度梯度。现在不知道还有哪些办法？能想到换启动子？换真核表达系统？或者还有好的办法？但是都很不熟悉那些方面的知识，希望大家有了解的可以帮帮我，在这里先谢谢大家了！
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1楼 2009-12-02 10:48:04
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lboo7

银虫 (小有名气)
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-2 12:32
十几个小时以后长的可能就是杂蛋白了,是大肠杆菌自身表达的蛋白,当然就不会看到目的蛋白了,你做IPTG浓度,或者低温诱导都没带的话,1.会不会是转BL21时就没有转进去,当时你做菌液PCR验证了没有啊.2,你应该先转DH5@才对啊，BL21是表达蛋白的菌株.3.这些你都作对的话,再做一下时间剃度吧.
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2楼2009-12-02 11:52:29
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lzhwin

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-2 12:32
楼上理解不正确，他的载体已经构建好了，现在是为了表达所以采用BL21。
我们现在也碰到这个问题，蛋白表达不出来。建议楼主再试一下16度诱导过夜吧？这大概是最后的手段了，如果不行就试试别的载体吧
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3楼2009-12-02 11:59:20
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)
谢谢楼上的两位，我的载体构建好测序也对，先转了DH-5@,后又转了表达菌株，也酶切检测了。我之前试过一次16℃，长得很慢，在不同的时间点取样也没看见条带。

有没有做过不用IPTG诱导，而是其他物质，或者载体有热启动子通过热诱导表达过的啊？
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4楼2009-12-02 12:19:44
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★
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先37度摇到需要的OD再用16度诱导，楼主顺序没搞错吧？
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5楼2009-12-02 12:40:50
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2009-12-2 12:40:
先37度摇到需要的OD再用16度诱导，楼主顺序没搞错吧？

只能再试试了，蛋白顺序没错，谢谢！
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6楼2009-12-02 13:37:19
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我用的是arcticexpress 10度24小时诱导 不行你试试这个
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7楼2009-12-02 15:41:38
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)
非常感谢！
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8楼2009-12-02 16:29:30
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lboo7

银虫 (小有名气)
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[quote]Originally posted by lboo7 at 2009-12-2 11:52:
是的,我只是看他的整个过程对不对
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9楼2009-12-02 16:31:49
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lboo7

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
在你转完BL21后,有没有做检测啊,如果检测转进去的话，一般情况下都会表达,只要培养基和抗生素没有问题的话.主要是纯化的时候需要做温度剃度检测,一般表达37度都可以.不过容易生成包含体.
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10楼2009-12-02 16:49:08
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