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青青向日葵

新虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白表达求助

我最近一段时间表达一个蛋白,怀疑这个蛋白有毒性(这个蛋白预想有切割活性),目前试了PET30a,pGEX-4T-1载体和大肠杆菌BL21DE3,rosetta表达株,在加完IPTG后宿主都出现生长抑制现象,不过十几小时之后又生长了,但SDS电泳都没看出条带,使用了25℃的低温,也做了IPTG的浓度梯度。现在不知道还有哪些办法?能想到换启动子?换真核表达系统?或者还有好的办法?但是都很不熟悉那些方面的知识,希望大家有了解的可以帮帮我,在这里先谢谢大家了!
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2009-12-2 12:40:
先37度摇到需要的OD再用16度诱导,楼主顺序没搞错吧?

只能再试试了,蛋白顺序没错,谢谢!
6楼2009-12-02 13:37:19
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lboo7

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-2 12:32
十几个小时以后长的可能就是杂蛋白了,是大肠杆菌自身表达的蛋白,当然就不会看到目的蛋白了,你做IPTG浓度,或者低温诱导都没带的话,1.会不会是转BL21时就没有转进去,当时你做菌液PCR验证了没有啊.2,你应该先转DH5@才对啊,BL21是表达蛋白的菌株.3.这些你都作对的话,再做一下时间剃度吧.
2楼2009-12-02 11:52:29
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lzhwin

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-2 12:32
楼上理解不正确,他的载体已经构建好了,现在是为了表达所以采用BL21。
我们现在也碰到这个问题,蛋白表达不出来。建议楼主再试一下16度诱导过夜吧?这大概是最后的手段了,如果不行就试试别的载体吧
3楼2009-12-02 11:59:20
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青青向日葵

新虫 (初入文坛)

谢谢楼上的两位,我的载体构建好测序也对,先转了DH-5@,后又转了表达菌株,也酶切检测了。我之前试过一次16℃,长得很慢,在不同的时间点取样也没看见条带。

有没有做过不用IPTG诱导,而是其他物质,或者载体有热启动子通过热诱导表达过的啊?
4楼2009-12-02 12:19:44
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