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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关构建质粒的一些问题
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LIU0118

[交流] 关构建质粒的一些问题

总是不能构建成功，连接完进行转化涂板都会长出很多的菌落，酶切鉴定无正确的，大多是载体自成环，请教一下应从哪些步骤来解决，请大侠多多帮忙~
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1楼 2009-11-19 10:37:28
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LIU0118

引用回帖:
Originally posted by 漫迹 at 2009-11-25 14:52:
请问楼主是单酶切还是双酶切，单酶切自连得可能性就是很大，但双酶切后进行切胶回收应该会好些的

双酶切，呵呵 已经构建成功啦 谢谢你的关注！
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16楼2009-11-25 15:02:31
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:27
self ligation的话就dephosphoralation
一般如果不是同一个酶切位点的话 多挑几个还是能挑出来的
挑不出来直接处理vector 脱磷酸后怎么它也自己连不起来了
赞一下(10人) 回复此楼
2楼2009-11-19 10:46:06
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grief

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:27
载体的酶切要保证完全，按照说明书上适当的扩大酶切体系和酶的用量，注意酶量不能超过体系的1/10。如果切下来的片段大的话，做个电泳，纯化回收。
连接的时候做阴性对照，如果对照平板上菌落太多，分析清楚原因在做，这样会好些的。
赞一下(11人) 回复此楼
等待秋天
3楼2009-11-19 11:14:57
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message

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用去磷酸化酶可以减少很多工作，换个好点的酶。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-11-19 15:45:01
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