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小白3521

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切啊,越切越没有

郁闷死了,这段时间做双酶切,最开始用的是takara的酶切的,我嫌切的久而且不亮,听说用fermentas的酶好,就换这个牌子的酶,结果这个酶反而切不下来,而且我现在用takara酶切,按照以前能够切出来的体系也切不出来了,很奇怪。会不会有种可能,是片段从质粒里丢失了?
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qingfengwu

金虫 (小有名气)

takara就OK

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 11-19 22:04
takara的酶已经很好了,尽量用takara的酶。因为这个公司在国内都有现货,到货非常快。ferment订个酶都要很久。因此尽量实验室的常规酶都用takara的。

另外,BSA不一定要加,根据takara说明书上的进行,有些需要BSA,有些根本不需要。

双酶切时,质粒的量浓度要测好,1-2 ug是需要的。
也不需要太长时间,有些酶比较差,比如XbaI和BamHI双酶切时候就会需要很长时间才能切得好。
12楼2009-11-19 21:58:24
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heismeng

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
多做些量吧 25做不出来的时候我都做100的体系
然后BSA加上 两个酶的比例再调一下
片段一般不会从质粒中丢失的 我好几个月的都继续切也没问题
2楼2009-11-19 10:43:19
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grief

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
你切下来的片段是多少个碱基?碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少,酶切量又少,不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶,质粒大约1ug就可以了!
菌种最好保持其抗性压力,如果你不确定基因片段是否还在载体中,最好做个PCR鉴定下。
等待秋天
3楼2009-11-19 10:52:11
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小白3521

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by grief at 2009-11-19 10:52:
你切下来的片段是多少个碱基?碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少,酶切量又少,不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶,质粒大约1ug就可以了!
菌种最好保持其抗性压力,如果你不确定基 ...

我的片段是400多的,我觉得我提的质粒就不是很亮,也不知道什么原因,用的试剂盒提的
4楼2009-11-19 11:07:49
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