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jjmm2009

[交流] 做定量PCR为什么要提RNA而不是DNA

有个很菜鸟的问题,定量也做了很久了,突然想到一个问题,为什么做定量PCR的时候要提取样本的RNA而不是DNA呢,请各位高手不吝赐教,非常感谢

还有一个,设计荧光定量PCR引物的时候我们都是跨内含子的,主要是怕DNA污染,那如果我的RNA提取之后用DNase I 处理过了,引物设计还一定要跨内含子吗?
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)


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一般作定量PCR的目的是看不同时间空间某个基因“活动”,一般而言就是在一个内参下看某种mRNA的丰度,所以。。。。

也可以用DNA,一般来做基因拷贝数的估算
2楼2009-11-12 20:53:31
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Entrez1110

定量PCR一般对某基因的mRNA表达水平定量,因为mRNA是合成蛋白的模板,蛋白质是机体生命活动执行者。基因组没有定量的意义(目前想不出有啥意义)。

跨内含子确实是防止DNA污染,虽说DNaseI可以去除DNA,但也不是100%的,加多一道防锁总没错,况且DNaseI去除DNA过程也存在人为因素,会损耗一些RNA。
3楼2009-11-12 20:59:44
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Entrez1110


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基因拷贝数用这种方法去判断?请高手赐教!
4楼2009-11-12 21:02:05
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jjmm2009

引用回帖:
Originally posted by Entrez1110 at 2009-11-12 21:02:
基因拷贝数用这种方法去判断?请高手赐教!

是啊,这个我也没听过,请解释下,谢谢
5楼2009-11-12 21:14:01
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jjmm2009

再问一个

请问各位高手,用DNAStar里的MegAlign进行序列比较时,可否直接将NCBI上查到的近缘的Gene序列和mRNA序列进行比对查找内含子,认为相同部分是外显子,有的相同的部分很短,只有几bp,也是一个外显子吗,谢谢
6楼2009-11-12 21:16:00
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Entrez1110

去Ensembl网站看看,哪里有标明内含子及外显子序列的。
7楼2009-11-12 21:23:38
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Entrez1110

8楼2009-11-12 21:24:09
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quiller2000

木虫 (著名写手)

real-time PCR 所检测的就是拷贝数,是底物(DNA,CDNA)的拷贝数
最开始这个技术的先行者是把EB加在PCR体系中,然后每两个循环取样定量来做的
现在有了激光和染料,做实时定量就更准确了
致良知
9楼2009-11-12 21:28:48
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mcl49510

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
定量PCR是检测表达程度的技术,可以直观的检测出一个基因在感兴趣的部位有无表达,表达的强度,要是抽提DNA则不能检测,因为DNA在所有的组织中都存在,是不能反映所研究的问题的,
10楼2009-11-14 10:03:40
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