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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR问题求助
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wwling

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR问题求助

最近做PCR超级不顺，扩增细菌16S,连非特异带都没有，只有很亮的100bp左右的引物二聚体。
  DNA模板以前用pfu扩得很好，但是最近换新买的taq酶了，没扩出来，做了退火温度梯度（50-60度）和mg+浓度梯度，都是只有引物二聚体。急问大家，酶的关系很大吗？也不至于连非特异带都没有吧？我的体系是20ul:
依次加入10×buffer         :2ul
                dNTP (10mM)  :0.4 ul
                引物上        :0.4ul
                引物下        :0.4ul
               模板           :1ul
               taq(5U/ul)           :    0.1 ul
              ddH2O                :15.7ul

   恳求虫子们帮忙分析分析。先谢谢了、、

另：有做土壤微生物的吗？，我的初提细菌DNA很深的颜色，褐色偏红，PCR也有问题，测了一下OD260,OD280,OD230，OD260/OD280只有1.4左右，而OD260/OD230只有1.0左右，我用氯仿抽提了好几次啊，怎么比值还这么低？不过发现OD260/OD280的水样DNA能扩出来，土壤的就是不行，大家知道大概什么数值范围合适吗？麻烦赐教。。
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1楼 2009-11-05 13:05:06
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pidou

木虫 (正式写手)
★ ★
350784478(金币+2,VIP+0):感谢回答 11-5 14:42
当然是纯度越好P出的效果也越好，楼主其中的颜色或许是色素的原因吧。
关于酶，我觉得那是相当关键，因为酶就是手术刀，没有手术刀了，你怎么做手术呢？？希望对你有用。
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2楼2009-11-05 13:09:42
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小小豆豆

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 11-5 17:27
纯度越好P出的效果越好，颜色深有可能是一些酚类物质，有分类物质存在的话，对后面的pcr有很大的影响，不知楼主是否在抽提过程中是否使用苯酚，另外，楼主可以在抽提过程中加一些pvp、巯基乙醇，可以帮助去除酚类物质。
OD260/OD280应该在1.8左右为好；
原来的酶做的很好，为什么要换啊，换酶后整个体系都要重新建
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3楼2009-11-05 15:36:06
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 11-5 17:27
没有扩出条带的原因很多，只换了Taq酶就P不出来吗？引物其他的东西换了吗？两次实验隔得时间久吗？久的话那可能是因为除酶以外的东西的降解而失败。从新在做一次，所有的试剂换新的，应该没有问题的。16S很容易扩出来的。
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4楼2009-11-05 16:36:23
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wwling

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小小豆豆 at 2009-11-5 15:36:
颜色深有可能是一些酚类物质，有分类物质存在的话，对后面的pcr有很大的影响，不知楼主是否在抽提过程中是否使用苯酚，另外，楼主可以在抽提过程中加一些pvp、巯基乙醇，可以帮助去除酚类 ...

十分感谢！我一直以为土壤中杂质的颜色
的确，在提取的时候用酚：氯仿抽提了3次
记得当时加入了酚时，溶液颜色从原来的褐色变成了微红色了
在土壤预处理的时候我加了PVPP，还想请问一下，抽提过程中也加PVP的话怎么个加法？pvp会分布到那一相呢？
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5楼2009-11-05 17:10:54
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wwling

铜虫 (小有名气)
1949stone(金币+0,VIP+0):宝生的还行 11-5 18:47
引用回帖:
Originally posted by fykxy_206 at 2009-11-5 16:36:
没有扩出条带的原因很多，只换了Taq酶就P不出来吗？引物其他的东西换了吗？两次实验隔得时间久吗？久的话那可能是因为除酶以外的东西的降解而失败。从新在做一次，所有的试剂换新的，应该没有问题的。16S很容易扩 ...

恩，是的，就换了个酶，换成了博大泰克的taq酶，挺便宜，1000U才30块。。。没这么倒霉吧，什么条带也没有
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6楼2009-11-05 17:12:49
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yunwalking

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 11-5 17:28
试试这个体系
                10×buffer         :2ul
                dNTP (10mM)  :1 ul
                引物上        :0.5ul
                引物下        :0.5ul
               模板           :1ul
              ddH2O                :14.8ul
              taq(5U/ul)           :    0.2ul
            （酶最后加）
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爱我中华~
7楼2009-11-05 17:12:52
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wwling

铜虫 (小有名气)
1949stone(金币+0,VIP+0):加入的量和体积无关 和反映的终浓度相关 11-5 18:47
引用回帖:
Originally posted by yunwalking at 2009-11-5 17:12:
试试这个体系
                10×buffer         :2ul
                dNTP (10mM)  :1 ul
                引物上        :0.5ul
                引物下        :0.5ul
               模板            ...

你好，恩，我会试一试 期待能有好结果
怎么这个体系的dNTP量这么大啊 以前50ul体系我也才加1ul
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8楼2009-11-05 17:29:37
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diaoyuhua

金虫 (小有名气)
多试试就会好了
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9楼2009-11-05 18:45:53
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wwling

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by diaoyuhua at 2009-11-5 18:45:
多试试就会好了

我今天用别的的mix做了下，扩出来了，不过有两条非特异带，估计是退火温度低了点（55度）
看来最有可能是我新买的酶不行。。。
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10楼2009-11-05 19:04:12
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