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汕头大学海洋科学接受调剂
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wwling

铜虫 (小有名气)


[交流] PCR问题求助

最近做PCR超级不顺,扩增细菌16S,连非特异带都没有,只有很亮的100bp左右的引物二聚体。
  DNA模板以前用pfu扩得很好,但是最近换新买的taq酶了,没扩出来,做了退火温度梯度(50-60度)和mg+浓度梯度,都是只有引物二聚体。急问大家,酶的关系很大吗?也不至于连非特异带都没有吧?我的体系是20ul:
依次加入10×buffer         :2ul
                dNTP (10mM)  :0.4 ul
                引物上        :0.4ul
                引物下        :0.4ul
               模板           :1ul
               taq(5U/ul)           :    0.1 ul
              ddH2O                :15.7ul

   恳求虫子们帮忙分析分析。先谢谢了、、

另:有做土壤微生物的吗?,我的初提细菌DNA很深的颜色,褐色偏红,PCR也有问题,测了一下OD260,OD280,OD230,OD260/OD280只有1.4左右,而OD260/OD230只有1.0左右,我用氯仿抽提了好几次啊,怎么比值还这么低?不过发现OD260/OD280的水样DNA能扩出来,土壤的就是不行,大家知道大概什么数值范围合适吗?麻烦赐教。。
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小小豆豆

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 11-5 17:27
纯度越好P出的效果越好,颜色深有可能是一些酚类物质,有分类物质存在的话,对后面的pcr有很大的影响,不知楼主是否在抽提过程中是否使用苯酚,另外,楼主可以在抽提过程中加一些pvp、巯基乙醇,可以帮助去除酚类物质。
OD260/OD280应该在1.8左右为好;
原来的酶做的很好,为什么要换啊,换酶后整个体系都要重新建
3楼2009-11-05 15:36:06
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pidou

木虫 (正式写手)

★ ★
350784478(金币+2,VIP+0):感谢回答 11-5 14:42
当然是纯度越好P出的效果也越好,楼主其中的颜色或许是色素的原因吧。
关于酶,我觉得那是相当关键,因为酶就是手术刀,没有手术刀了,你怎么做手术呢??希望对你有用。
2楼2009-11-05 13:09:42
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fykxy_206

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 11-5 17:27
没有扩出条带的原因很多,只换了Taq酶就P不出来吗?引物其他的东西换了吗?两次实验隔得时间久吗?久的话那可能是因为除酶以外的东西的降解而失败。从新在做一次,所有的试剂换新的,应该没有问题的。16S很容易扩出来的。
4楼2009-11-05 16:36:23
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wwling

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 小小豆豆 at 2009-11-5 15:36:
颜色深有可能是一些酚类物质,有分类物质存在的话,对后面的pcr有很大的影响,不知楼主是否在抽提过程中是否使用苯酚,另外,楼主可以在抽提过程中加一些pvp、巯基乙醇,可以帮助去除酚类 ...

十分感谢!我一直以为土壤中杂质的颜色
的确,在提取的时候用酚:氯仿抽提了3次
记得当时加入了酚时,溶液颜色从原来的褐色变成了微红色了
在土壤预处理的时候我加了PVPP,还想请问一下,抽提过程中也加PVP的话怎么个加法?pvp会分布到那一相呢?
5楼2009-11-05 17:10:54
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