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酰基转移酶（AAT）活性检测试剂盒实验解决方案
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原理 AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。CheKine™ 酰基转移酶（AAT）活性检测试剂盒（微量法）可检测生物体内AAT活性，其原理是：AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412 nm有特征吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。 自备耗材 ·酶标仪或可见分光光度计（能测412 nm处的吸光度） ·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头 ·恒温箱、制冰机、低温离心机 ·无水乙醇 ·匀浆器（如果是组织样本） 试剂准备 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。 Receptor：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。 Substrate：临用前96 T加入21.6 mL Receptor，48 T加入10.8 mL Receptor，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存一周，禁止反复冻融。 Chromogen：临用前96 T加入无水乙醇1.2 mL，48 T加入无水乙醇0.6 mL，充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存两周。 工作液的配制：每孔配制190 µL工作液：吸取180 µL溶解后的Substrate，10 µL Chromogen。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。 样本制备 注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。 1. 动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。 2. 植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。 3. 细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。 4. 血清（浆）等液体样本：直接测定。 注意：对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。 实验步骤 1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到412 nm，可见分光光度计用去离子水调零。 2. 恒温箱预热到37℃，工作液置于恒温箱中预热15 min。 3. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10 μL样本或Extraction Buffer，190 μL工作液，迅速混匀，37℃孵育2 min，测定412 nm处吸光值。样本的吸光值为A测，Extraction Buffer的吸光值为A空，计算ΔA测=A测-A空。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于1.5，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。 结果计算 注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。 A. 使用96孔板测定的计算公式 1. 按照蛋白浓度计算 活性单位定义：每mg蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AAT酶活(U/mg prot)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T×n=1,470.6×ΔA测÷Cpr×n 2. 按照样本质量计算 活性单位定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AAT酶活(U/g 鲜重)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T×n=1,470.6×ΔA测÷W×n 3. 按细胞或细菌数量计算 活性单位定义：每104个细胞或细菌每分钟催化产生1 nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AAT酶活(U/104)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞或细菌数量×V样÷V样总)÷T×n=1,470.6×ΔA测÷500×n=2.9412×ΔA测×n 4. 按液体体积计算 活性单位定义：每mL样本每分钟催化产生1 nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AAT酶活(U/mL)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T×n=1,470.6×ΔA测×n ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：提取液体积，1 mL；500：细胞或细菌总数，500万。 B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式 将上述计算公式中的光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。 结果展示 Figure 1. 小鼠肝脏、水稻叶子和玉米种子中的AAT活性。 |
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