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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了
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望风止水

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了 已有1人参与

一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个问题，不知道大家有何建议？
我们在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达，过程是：OD值 0.8左右加入IPTG(终浓度0.5mM），25℃诱导24h后取2mL离心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上样液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液离心后加入含8M尿素的binding buffer（因为怀疑目的蛋白在包涵体里面），然后超声破碎（200w，工作4S，间隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm离心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的两管，1管加上样液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，结果。直接菌液煮沸后看到了比较明显的目的条带（我同时做了2个目的蛋白，1个14 kDa左右，另1个35kDa左右），而后面几个处理的目的条带很弱，基本看不到，不知道怎么回事？
SDS-PAGE的图片请查看链接:
https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取码: k861
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1楼 2024-09-05 11:11:57
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望风止水

新虫 (小有名气)
SDS-PAGE电泳图，1和2是菌液直接煮沸电泳，3和4是上清，5和6是沉淀煮沸后电泳，7和8是沉淀未煮沸直接电泳
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2楼2024-09-05 11:16:28
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yandz680717

木虫 (正式写手)
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

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3楼2024-09-05 15:11:08
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望风止水

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandz680717 at 2024-09-05 15:11:08
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

测序没有问题，密码子是经过合成公司优化的
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4楼2024-09-05 19:39:18
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花开为缘

新虫 (小有名气)
试试16-18度诱导表达呢，另外可以试试rosetta感受态

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5楼2024-09-07 21:56:36
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小野说

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看你胶的背景，应该是上样的目的蛋白量不一致导致的（关注体积和浓度的变化），可以用考马斯亮蓝法或者使用标准品进行定量，或者其他的方法也行；
看你的胶片感觉像是包涵体，你的方法把好多步骤都糅合在一起了，使许多需要单独的步骤的目的变得不可控，建议你采用合适的方法来进行表达定位和后续的相关实验。
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6楼2024-09-09 14:44:58
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liyan1994

铁虫 (初入文坛)
如何是包涵体，就先发酵离心收湿菌，过程取未诱导、诱导的样品电泳验证表达，表达正常以后开始裂解菌体，加大肠裂解液裂解，裂解完成后离心，收取沉淀，沉淀洗涤两三遍，尽可能洗的干净一些，方便后续变复性，完成洗涤后，包涵体加含有8M尿素的缓冲液变性，这时候你跑电泳看一下，变性正常的话就开始复性。有需要可以加vx15824594272，我们做包涵体还是比较多的
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7楼2024-10-10 15:34:10
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