应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了
71/1返回列表
查看: 1959  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者望风止水将赠送您 10 个金币

望风止水

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了 已有1人参与

一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个问题，不知道大家有何建议？
我们在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达，过程是：OD值 0.8左右加入IPTG(终浓度0.5mM），25℃诱导24h后取2mL离心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上样液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液离心后加入含8M尿素的binding buffer（因为怀疑目的蛋白在包涵体里面），然后超声破碎（200w，工作4S，间隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm离心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的两管，1管加上样液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，结果。直接菌液煮沸后看到了比较明显的目的条带（我同时做了2个目的蛋白，1个14 kDa左右，另1个35kDa左右），而后面几个处理的目的条带很弱，基本看不到，不知道怎么回事？
SDS-PAGE的图片请查看链接:
https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取码: k861
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2024-09-05 11:11:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

望风止水

新虫 (小有名气)
SDS-PAGE电泳图，1和2是菌液直接煮沸电泳，3和4是上清，5和6是沉淀煮沸后电泳，7和8是沉淀未煮沸直接电泳
赞一下 回复此楼
2楼2024-09-05 11:16:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yandz680717

木虫 (正式写手)
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2024-09-05 15:11:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

望风止水

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandz680717 at 2024-09-05 15:11:08
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

测序没有问题，密码子是经过合成公司优化的
赞一下 回复此楼
4楼2024-09-05 19:39:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

花开为缘

新虫 (小有名气)
试试16-18度诱导表达呢，另外可以试试rosetta感受态

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2024-09-07 21:56:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小野说

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看你胶的背景，应该是上样的目的蛋白量不一致导致的（关注体积和浓度的变化），可以用考马斯亮蓝法或者使用标准品进行定量，或者其他的方法也行；
看你的胶片感觉像是包涵体，你的方法把好多步骤都糅合在一起了，使许多需要单独的步骤的目的变得不可控，建议你采用合适的方法来进行表达定位和后续的相关实验。
赞一下 回复此楼
6楼2024-09-09 14:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyan1994

铁虫 (初入文坛)
如何是包涵体，就先发酵离心收湿菌，过程取未诱导、诱导的样品电泳验证表达，表达正常以后开始裂解菌体，加大肠裂解液裂解，裂解完成后离心，收取沉淀，沉淀洗涤两三遍，尽可能洗的干净一些，方便后续变复性，完成洗涤后，包涵体加含有8M尿素的缓冲液变性，这时候你跑电泳看一下，变性正常的话就开始复性。有需要可以加vx15824594272，我们做包涵体还是比较多的
赞一下 回复此楼
7楼2024-10-10 15:34:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 望风止水 的主题更新
71/1返回列表
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 诚求调剂，323分 有专利/科研/实习经历 +5 橙子cyx 2026-03-06 6/300 2026-03-06 20:05 by wangjihu
[考研] 一志愿南京大学资源与环境专业283分求调剂 +6 追云?? 2026-03-04 6/300 2026-03-06 20:03 by wangjihu
[考研] 324求调剂 +5 wxz2 2026-03-03 8/400 2026-03-06 17:04 by 情长不过时光
[考研] 材料与化工328求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-02 4/200 2026-03-06 16:24 by @飒飒飒飒
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 17/850 2026-03-06 15:42 by 好好好1233
[考研] 0856材料与化工，270求调剂 +17 YXCT 2026-03-01 20/1000 2026-03-05 09:22 by 一切OK
[考研] 材料与化工，291分，求调剂 +9 咕噜咕噜123123 2026-03-04 11/550 2026-03-05 09:03 by 斩魂滴兔子！
[考研] 一志愿中石油，化学工程，301求调剂 +3 豚馒枳枳 2026-03-04 3/150 2026-03-04 18:32 by houyaoxu
[考研] 0703化学求调剂 +3 将未有期 2026-03-04 3/150 2026-03-04 16:19 by sslc1985
[考研] 295求调剂 +4 小赛不吃香菜 2026-03-04 4/200 2026-03-04 16:13 by sslc1985
[考研] 复试调剂 +4 杰尼龟aaa 2026-03-03 4/200 2026-03-03 23:06 by zhukairuo
[考博] 26申博 求博导 +3 爱读书的小帅 2026-02-28 5/250 2026-03-03 22:17 by 远方13579
[考研] 一志愿中科大能动297求调剂，本科川大 +3 邵11 2026-03-03 3/150 2026-03-03 14:50 by 新能源达人
[考研] 307求调剂 +6 wyyyqx 2026-03-01 6/300 2026-03-03 09:24 by 2235787770
[考研] 288求调剂 +3 少71.8 2026-03-02 5/250 2026-03-03 06:01 by tgxtgxtgx9
[考研] 285求调剂 +9 满头大汗的学生 2026-02-28 9/450 2026-03-02 20:29 by hypershenger
[考研] 一志愿华南理工大学材料与化工326分，求调剂 +3 wujinrui1 2026-02-28 3/150 2026-03-02 16:36 by chuocheng
[考研] 哈工大计算机刘劼团队招生 +4 hit_aiot 2026-03-01 6/300 2026-03-02 11:53 by 一声问好
[考研] 295求调剂 +8 19171856320 2026-02-28 8/400 2026-03-02 11:19 by yuchj
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭