应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了
71/1返回列表
查看: 2628  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者望风止水将赠送您 10 个金币

望风止水

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了 已有1人参与

一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个问题，不知道大家有何建议？
我们在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达，过程是：OD值 0.8左右加入IPTG(终浓度0.5mM），25℃诱导24h后取2mL离心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上样液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液离心后加入含8M尿素的binding buffer（因为怀疑目的蛋白在包涵体里面），然后超声破碎（200w，工作4S，间隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm离心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的两管，1管加上样液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，结果。直接菌液煮沸后看到了比较明显的目的条带（我同时做了2个目的蛋白，1个14 kDa左右，另1个35kDa左右），而后面几个处理的目的条带很弱，基本看不到，不知道怎么回事？
SDS-PAGE的图片请查看链接:
https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取码: k861
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2024-09-05 11:11:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

望风止水

新虫 (小有名气)
SDS-PAGE电泳图，1和2是菌液直接煮沸电泳，3和4是上清，5和6是沉淀煮沸后电泳，7和8是沉淀未煮沸直接电泳
赞一下 回复此楼
2楼2024-09-05 11:16:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yandz680717

木虫 (正式写手)
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2024-09-05 15:11:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

望风止水

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yandz680717 at 2024-09-05 15:11:08
先测序看看是不是有问题，如果没有问题，考虑是不是稀有密码子，可以转入Rossetta

测序没有问题，密码子是经过合成公司优化的
赞一下 回复此楼
4楼2024-09-05 19:39:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

花开为缘

新虫 (小有名气)
试试16-18度诱导表达呢，另外可以试试rosetta感受态

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2024-09-07 21:56:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小野说

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看你胶的背景，应该是上样的目的蛋白量不一致导致的（关注体积和浓度的变化），可以用考马斯亮蓝法或者使用标准品进行定量，或者其他的方法也行；
看你的胶片感觉像是包涵体，你的方法把好多步骤都糅合在一起了，使许多需要单独的步骤的目的变得不可控，建议你采用合适的方法来进行表达定位和后续的相关实验。
赞一下 回复此楼
6楼2024-09-09 14:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyan1994

铁虫 (初入文坛)
如何是包涵体，就先发酵离心收湿菌，过程取未诱导、诱导的样品电泳验证表达，表达正常以后开始裂解菌体，加大肠裂解液裂解，裂解完成后离心，收取沉淀，沉淀洗涤两三遍，尽可能洗的干净一些，方便后续变复性，完成洗涤后，包涵体加含有8M尿素的缓冲液变性，这时候你跑电泳看一下，变性正常的话就开始复性。有需要可以加vx15824594272，我们做包涵体还是比较多的
赞一下 回复此楼
7楼2024-10-10 15:34:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 望风止水 的主题更新
71/1返回列表
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭