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大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了已有1人参与
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一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个问题，不知道大家有何建议？ 我们在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达，过程是：OD值 0.8左右加入IPTG(终浓度0.5mM），25℃诱导24h后取2mL离心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上样液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液离心后加入含8M尿素的binding buffer（因为怀疑目的蛋白在包涵体里面），然后超声破碎（200w，工作4S，间隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm离心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的两管，1管加上样液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，结果。直接菌液煮沸后看到了比较明显的目的条带（我同时做了2个目的蛋白，1个14 kDa左右，另1个35kDa左右），而后面几个处理的目的条带很弱，基本看不到，不知道怎么回事？ SDS-PAGE的图片请查看链接: https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取码: k861 |
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yandz680717
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