| 查看: 1944 | 回复: 6 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者望风止水将赠送您 10 个金币 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
大肠杆菌原核表达，破碎后目的蛋白看不到了 已有1人参与
|
||
|
一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个问题，不知道大家有何建议？ 我们在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表达，过程是：OD值 0.8左右加入IPTG(终浓度0.5mM），25℃诱导24h后取2mL离心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上样液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液离心后加入含8M尿素的binding buffer（因为怀疑目的蛋白在包涵体里面），然后超声破碎（200w，工作4S，间隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm离心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的两管，1管加上样液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，结果。直接菌液煮沸后看到了比较明显的目的条带（我同时做了2个目的蛋白，1个14 kDa左右，另1个35kDa左右），而后面几个处理的目的条带很弱，基本看不到，不知道怎么回事？ SDS-PAGE的图片请查看链接: https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取码: k861 |
回复此楼» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有200人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
5楼2024-09-07 21:56:36
2楼2024-09-05 11:16:28
yandz680717
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 4749.1
- 散金: 100
- 红花: 3
- 帖子: 665
- 在线: 345.5小时
- 虫号: 1160259
- 注册: 2010-12-01
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
3楼2024-09-05 15:11:08
4楼2024-09-05 19:39:18
30