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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助;双酶切切不出来
汕头大学海洋科学接受调剂
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shell_ya

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助;双酶切切不出来

我用BamH1和Xhol1对质粒进行双酶切，用10微升体系切不到条带，加大为100微升体系的时候切到三条带。理应至切到两条带的，且三条带中也没有我要的目的条带。请教各位帮忙指导一下，谢谢！

[ Last edited by amisking on 2009-10-26 at 22:12 ]
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1楼 2009-10-26 21:53:27
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bigbangrex

铁杆木虫 (小有名气)
有图吗？什么质粒？
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2楼2009-10-26 22:51:04
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lywinan

捐助贵宾 (职业作家)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-27 08:18
1、个人感觉10微升的体系较小，酶的用量不要超过总体积的十分之一；而100微升的体系较大，如果切胶回收，我一般使用20微升的体系，可以切两个相同的体系，而后回收时过一个柱子；
2、设计双酶切时，要看目的片断中不要有酶切位点；
3、酶切前对质粒的质量进行控制，可以跑个质粒样品或在其他位点进行酶切验证，看是否是目的质粒
就想到这些
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3楼2009-10-26 22:58:15
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刘一笑

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
切的时间控制，双酶切不行就先后单切，你的酶切图谱一定仔细看分析一下，
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真实的活着，真实的追求，真实的享受，每一天的存在感
4楼2009-10-26 23:08:27
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by shell_ya at 2009-10-26 21:53:
我用BamH1和Xhol1对质粒进行双酶切，用10微升体系切不到条带，加大为100微升体系的时候切到三条带。理应至切到两条带的，且三条带中也没有我要的目的条带。请教各位帮忙指导一下，谢谢！

[ Last edited by am ...

先好好分析下质粒的图谱，看看这两个酶切位点到底有多少个。其实验证的话10ul的体系也就够了。如果你的质粒正确的话你可能少分析到了一个酶切位点。
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5楼2009-10-27 00:07:54
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tracy007

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是buffer的pH不适合呢
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6楼2009-10-27 10:51:54
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shell_ya

铁虫 (初入文坛)
请问过夜酶切的时间是不是太长了？一般多少小时可以？
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7楼2009-10-27 13:56:15
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xiaoai8039

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shell_ya at 2009-10-27 13:56:
请问过夜酶切的时间是不是太长了？一般多少小时可以？

我进行双酶切的时间是4-5h,过夜时间太长了，没有必要。
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8楼2009-10-27 19:44:03
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luckyyan

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tracy007 at 2009-10-27 10:51:
是不是buffer的pH不适合呢

上次NEB技术总监的产品介绍会上，她说：NEB好多酶5min。就可以完成酶切。可以酶切半小时左右。切得时间过长会有非特异条带出现。所谓没的星号活性。可以看看你所用酶的说明书。
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9楼2009-10-27 20:12:07
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