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构建新质粒载体
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基于蓝白斑筛选载体PUC57构建一种新的载体，此载体在LacZ的下游融合进一个致死基因CCDB，此基因在大肠杆菌内表达后会产生CCDB蛋白，此蛋白能灭活DNA旋转酶，从而导致宿主的死亡，因此，凡是有外源基因插入的载体宿主存活，没有外源基因片段插入的载体宿主死亡，即只要宿主存活，就说明载体连入了外源基因，简化了蓝白斑筛选。 本人从文献上得知这一原理，也进行过实验，但实验结果令人百思不得其解，发现存活的个体也有未插入片段的载体，或者载体本身在转换过程中被破坏。现请教广大虫友，不吝赐教，出谋划策，援手相助！ |
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gyesang
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Vectors Propagating Because of the lethal effects of the CcdB protein, all vectors containing the ccdB gene must be propagated in an E. coli strain that is resistant to CcdB effects. We recommend using the DB3.1™ E. coli strain which contains a gyrase mutation (gyrA462) that renders it resistant to the CcdB effects (Bernard and Couturier, 1992; Bernard et al., 1993; Miki et al., 1992). Genotype of DB3.1 F- gyrA462 endA1 ∆(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(Smr) xyl5 ∆leu mtl1 [ Last edited by gyesang on 2009-10-27 at 18:41 ] |
11楼2009-10-27 18:40:42
susizheng
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2楼2009-10-26 12:50:40
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zier1011
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1.致死基因连进去后，重组质粒转化大肠杆菌怎么生长？他不是让宿主致死了吗？ 2.如果你是提取空的质粒后，先连接了CCDB，然后有连接了其他的目的片段，最后再做转化，你怎么就能保证你的CCBD就一定正确连接了呢？难道要把两段基因都连接之后测序？ 3.如果你只是看了连接后的片段长度，那并不能说明CCBD连接进去就一定有活性的，我们平常在做克隆表达时，不是很多时候都没有活性的吗，要挑很多转化子，才有可能找到有表达的重组子，而且未必有活性！ 4.因此说，凭什么说连接进去的CCBD就一定能表达并且有活性呢？ 5.或者有其他的方法保证连接正确和表达成功并肯定有活性？等回答 |
4楼2009-10-26 15:07:42