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新虫 (初入文坛)

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[交流] 菌株荧光标记方法已有1人参与

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种理想的活体荧光标记分子，越来越多地被用于活细胞或微生物的定位、结构和动力学的研究，也可以通过测定GFP的荧光强度对菌株中GFP的表达量进行定量分析[1]。GFP已经在许多细菌中完成了转化，如：（1）利用GFP追踪了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠肠道内的定植情况；（2）利用GFP发现德氏乳杆菌D17嵌入在黏液层中，局部接近肠道的上皮细胞；（3）在植物乳杆菌WCFS1中进行GFP标记，研究WCFS1在肠道内的定植与分布。
红色荧光蛋白 (Red Fluorescent Protein, RFP)相比绿色荧光蛋白 (GFP)其灵敏度更高, 是基于GFP基础上的一种优良稳定的荧光蛋白。目前已在不同的菌株中成功进行RFP标记，如：（1）在根瘤菌中进行RFP荧光标记，可探究根瘤菌结瘤固氮能力及根瘤菌与土著菌竞争关系 [2]；（2）构建了以红色荧光蛋白基因 (dsred2) 为标记, 以α-淀粉酶 (amy) 为报告基因的表达载体, 成功实现了融合基因dsred2-amy在干酪乳杆菌中的融合表达；（3）铜绿假单胞菌中转入RFP标记，证实其在含油多孔物质中的迁移扩散及所受限制[3]；（4）在幽门26695中构建了GFP和RFP荧光标记，用于探究幽门的遗传调控和信号追踪[4]。
mCherry荧光蛋白也叫樱桃荧光蛋白，是从蘑菇珊瑚（mushroom coral）中分离出来的单体红色荧光蛋白，相较于其它单体荧光蛋白，其颜色和单体分子的光稳定性更强。mCherry荧光标记技术在细胞生物学、分子生物学和神经科学等多个领域都有广泛应用，用于追踪蛋白质、细胞器或其他生物大分子在活细胞中的分布和动态。近年来, mCherry用于荧光标记的研究报道逐渐增多, 相对其他荧光蛋白, 该荧光标记具有标记基因小、背景低等优点, 且与已报道的dsred2红色荧光基因相比, 其荧光强度及稳定性更好。目前已成功在多种菌株中进行标记：如：（1）成功在蒙氏肠球菌ST4SA和植物乳杆菌423中进行mCherry荧光蛋白标记；（2）在植物乳杆菌中进行mCherry荧光蛋白标记，是探究其在生物体内的定位、示踪及益生性作用机制的有效技术手段[5]。
实验流程：
1：构建荧光标记载体；
2：电转至受体菌；
3：涂布抗性筛选平板；
4：抗性筛选培养基扩大培养；
5：PCR验证质粒是否存在；
6：紫外验证荧光；
7：抗性筛选培养基扩大培养