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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大片段基因扩增不出来，求助
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段伏yyh

新虫 (初入文坛)

[求助] 大片段基因扩增不出来，求助 已有3人参与

课题需要做呼肠孤病毒反向遗传操作系统，扩增片段扩不出来，截断扩依旧不行。温度梯度，模版量和循环次数都做了优化，换了两款高保酶，还是不行。

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1楼 2024-04-04 16:51:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

云中子2014

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，写清楚片段长度，反应体系和条件
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科研路上无坦途
4楼2024-04-06 22:49:55
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普通回帖

雪落迷城

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的模板是什么？

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2楼2024-04-05 09:41:54
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xxzdjsw

版主 (职业作家)

我们都爱小木虫

优秀版主
多少kbp
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科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
3楼2024-04-06 05:14:55
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段伏yyh

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 雪落迷城 at 2024-04-05 09:41:54
你用的模板是什么？

cdna

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5楼2024-04-07 02:00:28
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段伏yyh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xxzdjsw at 2024-04-06 05:14:55
多少kbp

大的四千多截短到两千，依旧不行。准备试试巢式扩增

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6楼2024-04-07 02:01:52
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段伏yyh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 云中子2014 at 2024-04-06 22:49:55
首先，写清楚片段长度，反应体系和条件

都说了呼肠孤，反向遗传，高保酶，信息不够全么？你有空百度一下护肠孤就知道片段多大了，阁这说教谁呢？好大的威风啊

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7楼2024-04-07 02:04:48
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雪落迷城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 段伏yyh at 2024-04-07 02:00:28
cdna
...

扩增不出来，是指无条带？还是条带大小不对？从描述上看，感觉是扩增不出条带。如果无条带，可以先找一个确定能够扩增出来的基因作为阳性对照，排除模板、试剂或者操作问题，个人遇到过，最好换一批次模板。如果是条带大小不对，推测可能是是片段太长，或许分成三段会好一点。扩出来以后再通过多片段重组或者PCR的方式连起来。

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8楼2024-04-07 10:02:06
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段伏yyh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雪落迷城 at 2024-04-07 10:02:06
扩增不出来，是指无条带？还是条带大小不对？从描述上看，感觉是扩增不出条带。如果无条带，可以先找一个确定能够扩增出来的基因作为阳性对照，排除模板、试剂或者操作问题，个人遇到过，最好换一批次模板。如果是 ...

没有条带，换过四次模版了。也准备分段扩了融合。感谢

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9楼2024-04-07 23:56:10
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雪落迷城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 段伏yyh at 2024-04-07 23:56:10
没有条带，换过四次模版了。也准备分段扩了融合。感谢
...

或许可以试一试用普通的taq酶，如果能扩出来。取取正常体系的十分之一taq酶，加入高保真

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10楼2024-04-08 01:33:36
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