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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR反应两条引物Tm值相差很多怎么办？
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by l_inhumain at 2009-10-19 22:53:
我觉得很多时候由于引物的设计受到模板的控制，腾挪余地并不大，有些tm值相差很大，与引物设计规则差异也会很大，但大多数情况还是能够P出条带来的，不用太担心。设计的引物与规则越相符只能说明P出来的条带会好看 ...

哦  呵呵  真是太感激了！
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21楼2009-10-20 09:06:20
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-19 23:04:

对啊，不要有什么心理压力嘛，我觉得很简单，很正常的。

谢谢谢谢！
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22楼2009-10-20 09:06:50
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-19 23:04:

对啊，不要有什么心理压力嘛，我觉得很简单，很正常的。

还有一个问题，
我的Tm值 引物报告合成单上的和自己用软件计算出来的不一样，有一个相差6  我该用哪个比较好呢？
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23楼2009-10-20 09:09:03
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jinran

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还是做个梯度试试吧，每次相差2°C，哪个效果好就用哪个
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24楼2009-10-21 09:50:03
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-19 17:08:
其实我觉得影响不大，每次我都不按照Tm值PCR都，一般都用55℃拉，一般都可以拉的出来，不行的话就降低一下退火温度。

我用降落PCR  79到63  每个循环降0.5  没有出来条带   

又做了梯度PCR，从56到61  还是没有条带-------
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25楼2009-10-23 16:38:57
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xiangao

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 彩云朵朵 at 2009-10-20 09:09:

还有一个问题，
我的Tm值 引物报告合成单上的和自己用软件计算出来的不一样，有一个相差6  我该用哪个比较好呢？

以报告单为准，因为Tm计算方法不一样。软件好像只按原始公式Tm=4（G+T）+2(A+C)算的
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26楼2009-10-23 22:32:48
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kitty8682

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
按低的减5度试，如果没p出来，在逐度提高p
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27楼2009-10-24 08:30:56
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superyuanjia

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不知道有没有条件做梯度，我们一般做个梯度
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28楼2009-10-25 10:00:05
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)
昨天按原来的程序，降落PCR,从79到63，把延伸时间改为15分钟，循环改为35，酶换了mixture,出来了
明天再做一遍，检验一下
如果出来了，再向大家汇报哈
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29楼2009-10-25 16:05:07
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shenqinvwu

加甜菜碱试试
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30楼2009-10-26 08:34:32
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