应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Crisp-cas9敲除
61/1返回列表
查看: 1795  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hlp0809

新虫 (小有名气)

[交流] Crisp-cas9敲除 已有3人参与

有没有做过基因敲除的大佬，gibosn构建好的左右500bp同源臂和N20质粒，为什么后面诱导编辑失败呢？敲除不成功需要注意那些事项呢？

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2023-06-25 00:39:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzk234

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。
赞一下 回复此楼
2楼2023-07-05 17:07:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨ry

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by lzk234 at 2023-07-05 17:07:29
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。

大佬 我想问问我做cas9的时候，第一次预实验诱导cas9和重组酶表达，转化sgRNA质粒后，重组子都是正确的，后面再重复的时候，全是假阳性，有的长的很多，有的长的少；
不诱导cas9转化sgRNA质粒，预实验的时候克隆长得很多一个板几百个符合预期，但后面重复的时候就长得很少四五个这样子，但也都是假阳性，sgRNA的质粒就是第一次提出来的那些，是一样的，这是什么情况呢
赞一下 回复此楼
3楼2023-07-07 11:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzk234

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨ry at 2023-07-07 04:18:52
大佬 我想问问我做cas9的时候，第一次预实验诱导cas9和重组酶表达，转化sgRNA质粒后，重组子都是正确的，后面再重复的时候，全是假阳性，有的长的很多，有的长的少；
不诱导cas9转化sgRNA质粒，预实验的时候克隆长 ...

基因组修复分为同源重组修复和非同源重组修复，可能都是非同源重组修复吧，还有就是有些菌都逃过Cas9的切割了，然后被切的没有及时修复自身的基因组都死掉了，所以长出来的都是不对的，所以还是建议提高同源重组酶的诱导浓度。
赞一下 回复此楼
4楼2023-07-11 15:50:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hlp0809

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lzk234 at 2023-07-05 17:07:29
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。

感谢感谢

发自小木虫Android客户端
回复此楼
5楼2023-07-21 12:40:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by hlp0809 at 2023-07-21 12:40:33
感谢感谢
...

不知道楼主做出来没有，我记得当时硕士期间做敲除的时候有几个的地方我觉得挺关键的，一、诱导时间足够长，至少2小时。二、修复模板的浓度要提高，至少500ng/μL。阿拉伯糖浓度我当时是30mM做出来的，也没试过其他浓度。
赞一下 回复此楼
6楼2023-08-16 11:20:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hlp0809 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭