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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Crisp-cas9敲除
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hlp0809

新虫 (小有名气)

[交流] Crisp-cas9敲除 已有3人参与

有没有做过基因敲除的大佬，gibosn构建好的左右500bp同源臂和N20质粒，为什么后面诱导编辑失败呢？敲除不成功需要注意那些事项呢？

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1楼 2023-06-25 00:39:18
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lzk234

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。
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2楼2023-07-05 17:07:29
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杨ry

新虫 (初入文坛)
★
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2楼: Originally posted by lzk234 at 2023-07-05 17:07:29
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。

大佬 我想问问我做cas9的时候，第一次预实验诱导cas9和重组酶表达，转化sgRNA质粒后，重组子都是正确的，后面再重复的时候，全是假阳性，有的长的很多，有的长的少；
不诱导cas9转化sgRNA质粒，预实验的时候克隆长得很多一个板几百个符合预期，但后面重复的时候就长得很少四五个这样子，但也都是假阳性，sgRNA的质粒就是第一次提出来的那些，是一样的，这是什么情况呢
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3楼2023-07-07 11:18:52
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lzk234

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨ry at 2023-07-07 04:18:52
大佬 我想问问我做cas9的时候，第一次预实验诱导cas9和重组酶表达，转化sgRNA质粒后，重组子都是正确的，后面再重复的时候，全是假阳性，有的长的很多，有的长的少；
不诱导cas9转化sgRNA质粒，预实验的时候克隆长 ...

基因组修复分为同源重组修复和非同源重组修复，可能都是非同源重组修复吧，还有就是有些菌都逃过Cas9的切割了，然后被切的没有及时修复自身的基因组都死掉了，所以长出来的都是不对的，所以还是建议提高同源重组酶的诱导浓度。
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4楼2023-07-11 15:50:54
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hlp0809

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lzk234 at 2023-07-05 17:07:29
阿拉伯糖诱导浓度提高一下，终浓度提高到100-150mM再去试一下，望成功哈。

感谢感谢

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5楼2023-07-21 12:40:33
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
★
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5楼: Originally posted by hlp0809 at 2023-07-21 12:40:33
感谢感谢
...

不知道楼主做出来没有，我记得当时硕士期间做敲除的时候有几个的地方我觉得挺关键的，一、诱导时间足够长，至少2小时。二、修复模板的浓度要提高，至少500ng/μL。阿拉伯糖浓度我当时是30mM做出来的，也没试过其他浓度。
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6楼2023-08-16 11:20:59
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