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mynameisuu

[交流] 求教关于 跨外显子 设计引物的问题

我设计引物从来是按照引物设计原理(网上随便找的一大堆东西),但是我现在很纳闷,关于跨外显子设计引物,这到底是为什么呢?


网上的答案是 可以避免基因组DNA污染,我在想,污染什么了?如果跟的基因组DNA结合的话,如果跨了外显子,肯定是结合不上去的,如果没跨外显子,结合上去了,那么,尽管是基因组DNA扩增,扩增出来的仍然是我需要的序列啊(因为没有含内含子,就没有内含子的序列来捣乱了),跟结合在mRNA上有差么?


而如果我扩增的是 RACE,那么下/上游是通用引物,要扩全mRNA,不管在SP设计在哪,都是一样的


也就是说,跨外显子设计引物,实际上我认为只是在 实时定量PCR里才需要的,因为他们确实要了解,目标基因的mRNA在样本中的表达量,而对于要扩增单基因全长,为克隆基因而PCR的话,是不必跨外显子的,


不知道说的对不对?
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mascotte

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
mynameisuu(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+2,VIP+0): 9-30 08:24
楼主大概听错了,通常说的是跨越内含子设计引物。就是引物的上下游是在不同的外显子上,如果有genomic DNA污染,PCR出来的必然含有内含子片段,比mRNA批出来的片段要大。
2楼2009-09-30 03:45:43
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bioxixi

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by mascotte at 2009-9-30 03:45:
楼主大概听错了,通常说的是跨越内含子设计引物。就是引物的上下游是在不同的外显子上,如果有genomic DNA污染,PCR出来的必然含有内含子片段,比mRNA批出来的片段要大。

应该就是这个意思吧
3楼2009-09-30 08:20:58
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myxrosy

木虫 (小有名气)

不懂~~
4楼2009-09-30 08:28:00
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guyue2885

银虫 (正式写手)


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跨内含子设计引物  避免来自GDNA的干扰,直接得到cDNA片段
5楼2009-09-30 09:00:47
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寒山拾得

木虫 (小有名气)


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引用回帖:
Originally posted by mynameisuu at 2009-9-30 01:12:
我设计引物从来是按照引物设计原理(网上随便找的一大堆东西),但是我现在很纳闷,关于跨外显子设计引物,这到底是为什么呢?


网上的答案是 可以避免基因组DNA污染,我在想,污染什么了?如果跟的基因组DNA ...

应该是跨内含子。

做real time-PCR时一般是跨内含子,避免与基因组污染。普通克隆基因不避跨。
但做做real time-PCR时,如果增加了DNAseI 消化这一步,也不用设计跨内含子引物。
6楼2009-09-30 09:51:55
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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恩,单独克隆基因而PCR的话,是不必跨外显子的。
7楼2009-09-30 10:53:11
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xuezhen

银虫 (小有名气)

学习学习!
8楼2009-09-30 12:01:13
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mynameisuu

★ ★
生命核心(金币+2,VIP+0):恭喜楼主自己总结答案! 10-1 22:05
哎,还是我自己来个回答吧。。

还是要跨内含子的,因为。

1.DNA上的外显子拼成mRNA后貌似还要修饰,也就是说就算是外显子,也不全显,有点要被修饰掉,这样就会多出一点mRNA上没有的序列

第2,GDNA上还可能有失效的同源假基因,这样的话,大小都可能相似,只是没有遗传压力的假基因,让你得到的是完全没有意义的序列。


第一点,我还不确定,但是第二点是肯定无误的。
9楼2009-10-01 10:11:06
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mynameisuu

哎,还是我自己来个回答吧。。

还是要跨内含子的,因为。

1.DNA上的外显子拼成mRNA后貌似还要修饰,也就是说就算是外显子,也不全显,有点要被修饰掉,这样就会多出一点mRNA上没有的序列

第2,GDNA上还可能有失效的同源假基因,这样的话,大小都可能相似,只是没有遗传压力的假基因,让你得到的是完全没有意义的序列。


第一点,我还不确定,但是第二点是肯定无误的。
10楼2009-10-01 10:11:40
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