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银虫 (职业作家)

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[交流] GST纯化目的蛋白降解与有杂带

表达载体pgex-6p-1,表达株大肠bl21(de3),诱导条件：16℃、0.5mm iptg、220rpm,收菌高压破碎至溶液清亮(破菌液中加1mm dtt、1mm  pmsf），上清与2ml gst树脂4℃旋转结合4小时后，洗杂后用100u pp酶柱上酶切过夜，4℃旋转过夜，收集酶切样品，洗涤、洗脱。酶切样品超滤管浓缩（4℃离心），鉴定发现样品杂带比较多（泳道3），样品4℃放置16小时后目的条带明显减少，放置48小时后目的条带消失。对此有几个疑问请教大家：
  1.从图一泳道1.2可以看到，第二天早上收集到的酶切产物里，目的蛋白就已经存在降解情况了。造成降解的原因可能会是哪些呢？会是蛋白本身不稳定容易降解吗？还是bl21(de3)的蛋白酶不利于目的蛋白，需要换成蛋白酶缺陷型宿主菌？还会是残余pp酶的影响？(理论应该全部结合到树脂上，但根据图洗脱看出我的融合蛋白残余量挺多，可能会把树脂结合位点占满，导致一些pp酶被残留在溶液里)
  2.可以看到杂蛋白挺多，这种情况怎能改进呢？本次实验已经在结合洗杂洗脱溶液里加入了1mm dtt、0.1%tritonx-100.
  3.针对目的蛋白上方70kd左右那个杂蛋白，初步怀疑是大肠杆菌dnak基因产物，根据说明书用50mm tris-hcl、2mm atp、10mm mgso4，ph8.0(说明用7.
  4.我没调ph）37℃加热10分钟，发现那个条带没有消失（图2泳道1.2），这种情况如何去除它呢？
  5. 该基因我还构建了pet28（his标签，上清表达，表达量远低于gst融合蛋白相当）、pet32a(trxa+stag=his标签,胞内上清表达，表达量和gst融合蛋白相当），之前试过纯32a，杂带非常多，不知是不是降解原因。
  我是想得到1mg左右90%纯度目的蛋白，现在不知道是继续磕gst还是换成his

怎么上传不了图片呀