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[交流]
GST纯化目的蛋白降解与有杂带
表达载体pgex-6p-1,表达株大肠bl21(de3),诱导条件:16℃、0.5mm iptg、220rpm,收菌高压破碎至溶液清亮(破菌液中加1mm dtt、1mm pmsf),上清与2ml gst树脂4℃旋转结合4小时后,洗杂后用100u pp酶柱上酶切过夜,4℃旋转过夜,收集酶切样品,洗涤、洗脱。酶切样品超滤管浓缩(4℃离心),鉴定发现样品杂带比较多(泳道3),样品4℃放置16小时后目的条带明显减少,放置48小时后目的条带消失。对此有几个疑问请教大家:
1.从图一泳道1.2可以看到,第二天早上收集到的酶切产物里,目的蛋白就已经存在降解情况了。造成降解的原因可能会是哪些呢?会是蛋白本身不稳定容易降解吗?还是bl21(de3)的蛋白酶不利于目的蛋白,需要换成蛋白酶缺陷型宿主菌?还会是残余pp酶的影响?(理论应该全部结合到 树脂上,但根据图洗脱看出我的融合蛋白残余量挺多,可能会把树脂结合位点占满,导致一些pp酶被残留在溶液里)
2.可以看到杂蛋白挺多,这种情况怎能改进呢?本次实验已经在结合洗杂洗脱溶液里加入了1mm dtt、0.1%tritonx-100.
3.针对目的蛋白上方70kd左右那个杂蛋白,初步怀疑是大肠杆菌dnak基因产物,根据说明书用50mm tris-hcl、2mm atp、10mm mgso4,ph8.0(说明用7.
4.我没调ph)37℃加热10分钟,发现那个条带没有消失(图2泳道1.2),这种情况如何去除它呢?
5. 该基因我还构建了pet28(his标签,上清表达,表达量远低于gst融合蛋白相当)、pet32a(trxa+stag=his标签,胞内上清表达,表达量和gst融合蛋白相当),之前试过纯32a,杂带非常多,不知是不是降解原因。
我是想得到1mg左右90%纯度目的蛋白,现在不知道是继续磕gst还是换成his
怎么上传不了图片呀 |
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