| 查看: 1099 | 回复: 1 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 圆圈爱圈圆 的 250 个金币 | |||
[交流]
GST纯化目的蛋白降解与有杂带
|
|||
|
表达载体pgex-6p-1,表达株大肠bl21(de3),诱导条件：16℃、0.5mm iptg、220rpm,收菌高压破碎至溶液清亮(破菌液中加1mm dtt、1mm pmsf），上清与2ml gst树脂4℃旋转结合4小时后，洗杂后用100u pp酶柱上酶切过夜，4℃旋转过夜，收集酶切样品，洗涤、洗脱。酶切样品超滤管浓缩（4℃离心），鉴定发现样品杂带比较多（泳道3），样品4℃放置16小时后目的条带明显减少，放置48小时后目的条带消失。对此有几个疑问请教大家： 1.从图一泳道1.2可以看到，第二天早上收集到的酶切产物里，目的蛋白就已经存在降解情况了。造成降解的原因可能会是哪些呢？会是蛋白本身不稳定容易降解吗？还是bl21(de3)的蛋白酶不利于目的蛋白，需要换成蛋白酶缺陷型宿主菌？还会是残余pp酶的影响？(理论应该全部结合到 树脂上，但根据图洗脱看出我的融合蛋白残余量挺多，可能会把树脂结合位点占满，导致一些pp酶被残留在溶液里) 2.可以看到杂蛋白挺多，这种情况怎能改进呢？本次实验已经在结合洗杂洗脱溶液里加入了1mm dtt、0.1%tritonx-100. 3.针对目的蛋白上方70kd左右那个杂蛋白，初步怀疑是大肠杆菌dnak基因产物，根据说明书用50mm tris-hcl、2mm atp、10mm mgso4，ph8.0(说明用7. 4.我没调ph）37℃加热10分钟，发现那个条带没有消失（图2泳道1.2），这种情况如何去除它呢？ 5. 该基因我还构建了pet28（his标签，上清表达，表达量远低于gst融合蛋白相当）、pet32a(trxa+stag=his标签,胞内上清表达，表达量和gst融合蛋白相当），之前试过纯32a，杂带非常多，不知是不是降解原因。 我是想得到1mg左右90%纯度目的蛋白，现在不知道是继续磕gst还是换成his 怎么上传不了图片呀  |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有135人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
2楼2023-04-28 21:07:36
