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bclz铁杆木虫 (正式写手)
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[交流]
蛋白纯化
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| 各位大侠啊，我们在比赤酵母酵母中表达一个10KD左右的蛋白，由于种种原因，没有加His标签，现在诱导表达后，上清中的蛋白怎么纯化啊？其实不要求纯度太高。。急问，先谢谢谢谢大家了 |
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2楼2009-09-28 11:17:22
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7楼2009-10-07 19:24:25
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楼主，我有这方面的经验， 你最好知道该蛋白的等电点， 如果不知道，就从pH7开始一直做到11 即： pH 7、8、9、10、11用各类缓冲液挂DEAE柱。 先装2mL的胶， 将离心很清亮的发酵液上清直接上就行， 一般可以上10-50个体积。 （酵母发酵液不易用硫酸铵沉淀来做，因为你会发现，沉淀的效率不高，这一步就相当于浓缩N倍的蛋白） 先让蛋白全部挂柱（离子交换法浓缩蛋白，^_^）， 这样可以大体估计该蛋白的等电点， 摸好挂柱条件后， 就再优化洗脱液的pH，一样是从pH7到11， 注意操作时发酵液穿出和洗脱液要随时收集蛋白峰， 然后走SDS-PAGE， 这样可以随时判断各种蛋白的挂柱洗脱pH条件。 最终，DEAE柱洗脱时收集目的蛋白洗脱峰的后半峰，那样会更纯些！ 许多时候，少量的蛋白样品，DEAE一个胶就基本搞定。 当然，这种纯化是不太考虑收率的哦。 [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-7 at 19:54 ] |
8楼2009-10-07 19:49:33
9楼2009-10-07 21:19:09
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10楼2009-10-24 12:59:41
