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bclz

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[交流] 蛋白纯化

各位大侠啊，我们在比赤酵母酵母中表达一个10KD左右的蛋白，由于种种原因，没有加His标签，现在诱导表达后，上清中的蛋白怎么纯化啊？其实不要求纯度太高。。急问，先谢谢谢谢大家了

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1楼2009-09-28 11:13:43

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HarveyWang

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amisking(金币+5,VIP+0): 10-7 19:57

引用回帖:

Originally posted by bclz at 2009-10-7 19:24:
谢谢大家了，呵呵。我试试吧。

楼主，我有这方面的经验，
你最好知道该蛋白的等电点，
如果不知道，就从pH7开始一直做到11
即： pH 7、8、9、10、11用各类缓冲液挂DEAE柱。

先装2mL的胶，
将离心很清亮的发酵液上清直接上就行，
一般可以上10-50个体积。
（酵母发酵液不易用硫酸铵沉淀来做，因为你会发现，沉淀的效率不高，这一步就相当于浓缩N倍的蛋白）

先让蛋白全部挂柱（离子交换法浓缩蛋白，^_^），
这样可以大体估计该蛋白的等电点，

摸好挂柱条件后，
就再优化洗脱液的pH，一样是从pH7到11，

注意操作时发酵液穿出和洗脱液要随时收集蛋白峰，
然后走SDS-PAGE，
这样可以随时判断各种蛋白的挂柱洗脱pH条件。

最终，DEAE柱洗脱时收集目的蛋白洗脱峰的后半峰，那样会更纯些！

许多时候，少量的蛋白样品，DEAE一个胶就基本搞定。
当然，这种纯化是不太考虑收率的哦。

[ Last edited by HarveyWang on 2009-10-7 at 19:54 ]