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CipherLee

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌BL21 CrisprCas9基因敲除

最近在用双质粒系统pCas和ptargetF做BL21的基因敲除,敲出效率非常低,一个半月只敲掉了一个基因,有大佬指点一下这个实验有什么需要注意的嘛,效率为什么这么低,敲不掉是常事,我的ptargetF都测序了 都构建成功的,pcas也是转进去了,其他就和大肠杆菌的常规操作一样了,为什么敲不掉呀

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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黄黑波波

新虫 (小有名气)

楼主如果是用dsDNA做同源交換的話建议上下游同源臂有500bp左右,而且加上抗性筛选的话就很明显,其他操作按照杨晟的文章应该是问题不大的,感受态浓度尽可能的浓,dsDNA也建议到300~1000ng/μl

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2楼2023-04-12 19:42:03
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黄黑波波

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄黑波波 at 2023-04-12 19:42:03
楼主如果是用dsDNA做同源交換的話建议上下游同源臂有500bp左右,而且加上抗性筛选的话就很明显,其他操作按照杨晟的文章应该是问题不大的,感受态浓度尽可能的浓,dsDNA也建议到300~1000ng/μl
...

当然若是同源交換的片段放在质粒上,敲除效率肯定比线性片段的好

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3楼2023-04-12 19:44:24
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