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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 大肠杆菌BL21 CrisprCas9基因敲除
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CipherLee

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌BL21 CrisprCas9基因敲除

最近在用双质粒系统pCas和ptargetF做BL21的基因敲除，敲出效率非常低，一个半月只敲掉了一个基因，有大佬指点一下这个实验有什么需要注意的嘛，效率为什么这么低，敲不掉是常事，我的ptargetF都测序了 都构建成功的，pcas也是转进去了，其他就和大肠杆菌的常规操作一样了，为什么敲不掉呀

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2023-04-12 15:50:38
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黄黑波波

新虫 (小有名气)
楼主如果是用dsDNA做同源交換的話建议上下游同源臂有500bp左右，而且加上抗性筛选的话就很明显，其他操作按照杨晟的文章应该是问题不大的，感受态浓度尽可能的浓，dsDNA也建议到300～1000ng/μl

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2楼2023-04-12 19:42:03
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黄黑波波

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄黑波波 at 2023-04-12 19:42:03
楼主如果是用dsDNA做同源交換的話建议上下游同源臂有500bp左右，而且加上抗性筛选的话就很明显，其他操作按照杨晟的文章应该是问题不大的，感受态浓度尽可能的浓，dsDNA也建议到300～1000ng/μl
...

当然若是同源交換的片段放在质粒上，敲除效率肯定比线性片段的好

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3楼2023-04-12 19:44:24
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