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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 构建出来的质粒重新酶切切不出来了
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20022002db

[交流] 构建出来的质粒重新酶切切不出来了

大家好，我之前构建了一系列质粒，送测序也都是对的，但是后来再重新提质粒怎么切也切不出来了，谁能帮我解释一下啊，谢谢了

[ Last edited by amisking on 2009-9-27 at 20:44 ]
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1楼 2009-09-25 11:39:27
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gyesang

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amisking(金币+3,VIP+0): 9-27 20:44
看看你用的酶是否是甲基化敏感的，再看看你的酶切位点中是否有Dam 的甲基化序列GATC或Dcm 甲基化的序列GGA/TCC，可能你构建好的载体转到大肠杆菌里面去，再提出来的质粒，酶切位点被甲基化了，所以酶切不开
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4楼2009-09-25 19:46:25
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
看看酶切位点突变没。
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2楼2009-09-25 15:20:21
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695

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amisking(金币+3,VIP+0): 9-27 20:44
我也遇到过这样的问题，多挑几个菌试试吧，还有就是酶切时间的问题，如果酶量不多，体系不大的话，最好不要时间太长
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3楼2009-09-25 15:25:58
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wsshforget

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amisking(金币+2,VIP+0): 9-27 20:44
你是大提还是小提，是用试剂盒还是手提？要是手提的话注意溶液2的问题，还要注意酶是不是失活了。
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5楼2009-09-27 09:29:37
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yanfeier

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amisking(金币+2,VIP+0): 9-27 20:44
多能几组试试看   注意酶切的步骤掌握，可以看一些酶切的技巧，很有帮助。我也遇到过类似的情况。
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6楼2009-09-27 20:35:07
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chaoziluo

木虫 (正式写手)
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我也遇到过这样得情况，每次都是PCR 验证效果非常好，特异性强。但是一酶切验证就不行了，后来在10UL体系多加一点质粒，跑胶时时间不要太长。呈像时曝光时间长点，在不行就直接在紫外灯下看吧。
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静坐常思己过，闲谈莫论人非！
7楼2009-09-27 21:53:56
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wulie0411

木虫 (小有名气)
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是不是没有加入酶切位点的保护碱基
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8楼2009-09-28 08:25:36
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
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可能是质粒提取提取的质量不好吧！你把质粒纯化一下，然后再做酶切。你是要做酶切验证呢？还是酶切后要连接到其他载体上？既然都测序正确啦，如果仅是验证的话，不酶切也没多大关系吧？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
9楼2009-09-28 08:55:39
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
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哪两个酶？别是同尾酶。
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10楼2009-09-28 15:40:04
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