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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于大片段基因的引物设计
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 关于大片段基因的引物设计

本人现在需要设计一个基因的引物，基因有12000多bp,现需设计一对引物，要求PCR产物的大小为2KB~5KB，将该基因的12000多bp序列导入Primer 后，会弹出个对话框，写着：“more than 30000 possible primers. Optimal primers search will be exceedingly time consuming.Please reduce anti-sense primer search range。”想请问各位有什么更好的设计引物的方法来获得该基因啊？？  谢谢达人。。。
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1楼 2009-09-22 19:57:55
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菊花茶

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 9-22 20:23
30000多，都能扩出你的产物吗？
要看你的产物在哪一段，然后用primer5设计，应该不困难，先选择前后primer在哪个范围最合适，再根据Tm值，GC含量，二聚体，错配等进行编辑取舍
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2楼2009-09-22 20:12:43
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 菊花茶 at 2009-9-22 20:12:
30000多，都能扩出你的产物吗？
要看你的产物在哪一段，然后用primer5设计，应该不困难，先选择前后primer在哪个范围最合适，再根据Tm值，GC含量，二聚体，错配等进行编辑取舍

是啊，关键是那所谓的30000多个的分值都很低，而且二聚体啦，错配啦什么的都有，值还很大。。。。唉，有点犯难，不知道该如何设计。。。。
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3楼2009-09-22 20:53:35
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
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剪掉一部分序列再设计引物即可

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-22 at 21:00 ]
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4楼2009-09-22 20:58:39
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changes

木虫 (正式写手)
★
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调整下引物长度范围，默认一般为20~2，你调整下试试。
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5楼2009-09-22 21:36:46
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695

木虫 (职业作家)
在线设计软件也蛮好的
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6楼2009-09-23 00:28:06
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bioxixi

木虫 (著名写手)
没有扩过这么长的，觉得引物可能不是问题，酶能扩这么长吗？会不会有很多错配。。。
不知道楼主做什么用途，可以一段一段扩，再拼接
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7楼2009-09-23 08:52:49
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bioxixi at 2009-9-23 08:52:
没有扩过这么长的，觉得引物可能不是问题，酶能扩这么长吗？会不会有很多错配。。。
不知道楼主做什么用途，可以一段一段扩，再拼接

恩，是想做该基因的同源重组的，本来是想克隆到该基因的5端跟3端的一段同源臂，可是PCR的时候有很多的非特异性条带，现在是想验证下我的材料中到底有没有含有这个基因，所以需要设计引物看看能否P出这个基因的全长。。。
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8楼2009-09-23 09:25:44
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
★
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你是不是没有限制产物的长度啊，12kb的不可能有30000个可能的pr的，建议改一下下面的产物长度再试一试，还有就是这么长的产物，普通的taq是不行的，要购买长产物Taq（LTaq）
预祝实验成功。。。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
9楼2009-09-23 14:22:54
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 經天 at 2009-9-23 14:22:
你是不是没有限制产物的长度啊，12kb的不可能有30000个可能的pr的，建议改一下下面的产物长度再试一试，还有就是这么长的产物，普通的taq是不行的，要购买长产物Taq（LTaq）
预祝实验成功。。。

谢谢，导师要求最好产物的长度是在2~5KB的。。。
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10楼2009-09-23 20:03:43
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