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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pcr产物加A后用不用纯化后再连T载体啊
汕头大学海洋科学接受调剂
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] pcr产物加A后用不用纯化后再连T载体啊

最近在做t-a连接，转化感受态细胞后总是不长斑，怀疑是加A后没有纯化造成的，我用的是全式金的t载体，想听听大家的意见
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1楼 2009-09-19 18:34:50
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 9-19 19:45
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-19 19:50
加A后纯化是最好的，当然不出话也行，TA克隆完全可以长的出来。TA克隆是很好长的，如果你一个都没长出来的话，是不是的你的抗性搞错了？
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2楼2009-09-19 18:53:35
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cato8163

银虫 (正式写手)
★
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-19 19:50
2楼说的有道理。
一般很好连的。
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3楼2009-09-19 19:22:11
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
你们一边用什么样的加A体系啊   长出的白斑一般有多少啊
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4楼2009-09-19 19:52:09
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by huangdi07 at 2009-9-19 19:52:
你们一边用什么样的加A体系啊   长出的白斑一般有多少啊

体系和正常PCR的是一样的，不加引物和模板而已，引物和模板的体积用dd水补。
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5楼2009-09-19 21:18:47
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huanshi

银虫 (小有名气)
建议你考虑换载体。。

前几天我试用了下全式金的t载体，同时和promega的T载体做比较。。

全式金的什么也没长出来，promega的还可以。。

另外：建议用T4连接酶，更稳定。。
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6楼2009-09-19 21:29:12
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xiangao

金虫 (正式写手)
是不是感受态有问题？
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7楼2009-09-19 21:43:20
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★ ★
huangdi07(金币+2,VIP+0): 9-20 09:02
楼主，你得一起做一个空质粒载体的转化，用来做阴性对照，以此来看你的感受态细胞和你的转化操作过程是否有问题。否则你上面说的情况原因会有很多。。
      前天我刚做了一个TA克隆，片段也是由平端的线性片段加A来的。以下是详细情况：
30微升的加A反应体系，其中平端片段15微升，Taq polymerase1微升，dNTP 0.5微升，Mg离子2.5微升（25mM），其余是BUFFER和水。72摄氏度恒温30分钟。平端片段的浓度我没有仔细定量，觉得浓度不低，跑电泳时挺亮的。
然后直接过柱纯化（不用跑电泳），回收就可以了。
连接很简单，就加水，缓冲液，片段，T载体和T4DNA连接酶就好了，其中T载体是pTG-19T载体，浓度好像是20ng每微升。我用了2微升。。
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8楼2009-09-19 22:14:57
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
我做了性对照，并且用puc18做了阳性对照，阴性对照平板没有长菌落，而阳性对照菌落长的很密，你们加A后转化前对加A后的产物纯化了么
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9楼2009-09-20 09:04:22
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
不纯化
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仕不可不弘毅，任重而道远
10楼2009-09-20 11:02:29
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