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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

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[交流] pcr产物加A后用不用纯化后再连T载体啊

最近在做t-a连接，转化感受态细胞后总是不长斑，怀疑是加A后没有纯化造成的，我用的是全式金的t载体，想听听大家的意见

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1楼 2009-09-19 18:34:50

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spiderboy

金虫 (正式写手)

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★ ★
huangdi07(金币+2,VIP+0): 9-20 09:02

楼主，你得一起做一个空质粒载体的转化，用来做阴性对照，以此来看你的感受态细胞和你的转化操作过程是否有问题。否则你上面说的情况原因会有很多。。
前天我刚做了一个TA克隆，片段也是由平端的线性片段加A来的。以下是详细情况：
30微升的加A反应体系，其中平端片段15微升，Taq polymerase1微升，dNTP 0.5微升，Mg离子2.5微升（25mM），其余是BUFFER和水。72摄氏度恒温30分钟。平端片段的浓度我没有仔细定量，觉得浓度不低，跑电泳时挺亮的。
然后直接过柱纯化（不用跑电泳），回收就可以了。
连接很简单，就加水，缓冲液，片段，T载体和T4DNA连接酶就好了，其中T载体是pTG-19T载体，浓度好像是20ng每微升。我用了2微升。。