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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] pcr产物加A后用不用纯化后再连T载体啊

最近在做t-a连接,转化感受态细胞后总是不长斑,怀疑是加A后没有纯化造成的,我用的是全式金的t载体,想听听大家的意见
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spiderboy

金虫 (正式写手)

★ ★
huangdi07(金币+2,VIP+0): 9-20 09:02
楼主,你得一起做一个空质粒载体的转化,用来做阴性对照,以此来看你的感受态细胞和你的转化操作过程是否有问题。否则你上面说的情况原因会有很多。。
      前天我刚做了一个TA克隆,片段也是由平端的线性片段加A来的。以下是详细情况:
30微升的加A反应体系,其中平端片段15微升,Taq polymerase1微升,dNTP 0.5微升,Mg离子2.5微升(25mM),其余是BUFFER和水。72摄氏度恒温30分钟。平端片段的浓度我没有仔细定量,觉得浓度不低,跑电泳时挺亮的。
然后直接过柱纯化(不用跑电泳),回收就可以了。
连接很简单,就加水,缓冲液,片段,T载体和T4DNA连接酶就好了,其中T载体是pTG-19T载体,浓度好像是20ng每微升。我用了2微升。。
8楼2009-09-19 22:14:57
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 9-19 19:45
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-19 19:50
加A后纯化是最好的,当然不出话也行,TA克隆完全可以长的出来。TA克隆是很好长的,如果你一个都没长出来的话,是不是的你的抗性搞错了?
2楼2009-09-19 18:53:35
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cato8163

银虫 (正式写手)


huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-19 19:50
2楼说的有道理。
一般很好连的。
3楼2009-09-19 19:22:11
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

你们一边用什么样的加A体系啊   长出的白斑一般有多少啊
4楼2009-09-19 19:52:09
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