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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 融合蛋白目的蛋白不表达（急 在线等）
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stefa

新虫 (小有名气)

[交流] 融合蛋白目的蛋白不表达（急 在线等）

最近用PGEX-6p-1做表达载体 BL21作为宿主菌做原核表达
但是跑完SDS-PAGE后发现
导入重组质粒表达出来的蛋白和导入空质粒的菌表达出来的蛋白条带差不多
在26K这个位置都有明显的GST条带出现
请问这是怎么回事啊
重组质粒做过酶切验证 证实确实导入进了宿主菌
目的基因的三联体分析 也没有发现移码

[ Last edited by stefa on 2009-9-18 at 14:23 ]
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1楼 2009-09-18 14:19:05
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
诱导表达了嘛？
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2楼2009-09-18 14:45:26
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stefa

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-18 14:45:
诱导表达了嘛？

恩 表达的GST蛋白很明显
但连有目的蛋白的GST融合蛋白却看不到
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3楼2009-09-18 14:53:18
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
stefa(金币+1,VIP+0): 9-18 15:32
也就是说诱导后有表达，不过看起来表达的是空载体的GST标签，而不是融合蛋白，据你的表述表达并没有被错误终止，是不是重组质粒没有转入表达菌株呢，做个PCR检验一下，因为你测序肯定是用克隆菌株测得。
之前我也有过表达不出蛋白的经历，但是是融合蛋白完全不表达，你这既然表达GST说明是重组的问题的可能性大一些，再检验一下啊。
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4楼2009-09-18 15:11:33
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stefa

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bioxixi at 2009-9-18 15:11:
也就是说诱导后有表达，不过看起来表达的是空载体的GST标签，而不是融合蛋白，据你的表述表达并没有被错误终止，是不是重组质粒没有转入表达菌株呢，做个PCR检验一下，因为你测序肯定是用克隆菌株测得。
之前我也 ...

EN  我再做个PCR验证看看
如过证实重组质粒转入了表达菌株 那又该是什么问题呢
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5楼2009-09-18 15:34:13
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
构建重组质粒的时候应该测过序了吧？有没有发生突变？
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6楼2009-09-18 15:35:02
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stefa

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-18 15:35:
构建重组质粒的时候应该测过序了吧？有没有发生突变？

没有突变  在gene bank上对比过了很一致
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7楼2009-09-18 15:44:15
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stefa

新虫 (小有名气)
我的目的基因片段有1.2Kb 不知道是不是太大 表达不了？
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8楼2009-09-18 15:47:21
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stefa

新虫 (小有名气)
快来救命啊
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9楼2009-09-18 18:54:42
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xiangao

金虫 (正式写手)
本来融合蛋白就不好表达，可能前面的蛋白有抑制。以前做过AB两基因串联表达，A表达，B不表达或量很少
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10楼2009-09-18 19:03:42
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