24小时热门版块排行榜    

查看: 574  |  回复: 5
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

04swlcm

金虫 (小有名气)


[交流] PCR产物直接酶切问题求助

最近做易错PCR方法的酶定向进化,转化老是不成功,现在找出原因是PCR产物直接酶切,没切出粘性末端,所以连不上,我一直用的是宝生物的酶,有时切4-6h,有时过夜都切不开。
希望请高手帮忙,提点意见和看法!谢谢了
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

goonhetty

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物酶切时,引物要加保护碱基的!
5楼2009-09-19 09:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我们实验室用fermentas的酶试过,pcr产物酶切是可以切出来的,不过还是推荐pcr-回收-酶切-回收-连接  这个过程,虽然是麻烦了点。但是易错pcr就是追求小概率事件还是小心一点好,回收尽量用好的kit。
还有你的酶切位点是飘在引物上还是在你的pcr的条带上,最好还是放在引物上比较好,这样保证你可以切开,如果在易错pcr条带的范围内,很可能酶切位点就被直接突变了。
ps:你的金币够升级了

[ Last edited by jerryqpr on 2009-9-17 at 19:28 ]
铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
2楼2009-09-17 19:27:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

04swlcm

金虫 (小有名气)


谢谢,试试哈,我一直用的TaKaRa的,新买了fermentas的酶试哈,我是按着你的方案做的,我发觉做分子靠运气!
3楼2009-09-18 22:48:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你要了解为何切不动
PCR体系残存的Taq酶、dNTP、引物,以及不恰当的离子强度等,都是导致酶切失败的原因。
一般是要经过clean-up再酶切的
4楼2009-09-19 08:56:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程(085601) +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[考研] 08工学调剂 +7 用户573181 2026-03-20 12/600 2026-03-24 11:17 by 用户573181
[考研] 344求调剂 +3 desto 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:09 by 搏击518
[考研] 材料专硕找调剂 +3 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 3/150 2026-03-23 23:13 by peike
[考研] 265求调剂 +10 梁梁校校 2026-03-17 10/500 2026-03-23 21:17 by 一切OK
[考研] 070300化学求调剂 +8 苑豆豆 2026-03-20 8/400 2026-03-23 20:57 by baobaoye
[考研] 0703化学求调剂 +4 奶油草莓. 2026-03-22 5/250 2026-03-23 19:37 by pswait
[考研] 一志愿陕师大生物学071000,298分,求调剂 +3 SYA! 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:09 by macy2011
[考研] 328求调剂 +4 LHHL66 2026-03-23 4/200 2026-03-23 14:55 by lbsjt
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +8 tcxiaoxx 2026-03-20 9/450 2026-03-23 12:16 by tcxiaoxx
[考研] 315分,诚求调剂,材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-20 7/350 2026-03-21 16:36 by barlinike
[考研] 材料学学硕080502 337求调剂-一志愿华中科技大学 +4 顺顺顺mr 2026-03-18 5/250 2026-03-21 10:22 by luoyongfeng
[考研] 332求调剂 +4 ydfyh 2026-03-17 4/200 2026-03-21 02:20 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ,070300化学学硕,总分287,双非一本,求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南昌大学,327分,材料与化工085600 +9 Ncdx123456 2026-03-19 9/450 2026-03-20 23:41 by lovewei0727
[考研] 0856调剂,是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
[考研] 一志愿福大288有机化学,求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
信息提示
请填处理意见