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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR产物直接酶切问题求助
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] PCR产物直接酶切问题求助

最近做易错PCR方法的酶定向进化，转化老是不成功，现在找出原因是PCR产物直接酶切，没切出粘性末端，所以连不上，我一直用的是宝生物的酶，有时切4-6h，有时过夜都切不开。
希望请高手帮忙，提点意见和看法！谢谢了
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1楼 2009-09-17 18:16:33
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jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我们实验室用fermentas的酶试过，pcr产物酶切是可以切出来的，不过还是推荐pcr-回收-酶切-回收-连接  这个过程，虽然是麻烦了点。但是易错pcr就是追求小概率事件还是小心一点好，回收尽量用好的kit。
还有你的酶切位点是飘在引物上还是在你的pcr的条带上，最好还是放在引物上比较好，这样保证你可以切开，如果在易错pcr条带的范围内，很可能酶切位点就被直接突变了。
ps：你的金币够升级了

[ Last edited by jerryqpr on 2009-9-17 at 19:28 ]
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铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
2楼2009-09-17 19:27:20
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04swlcm

金虫 (小有名气)
谢谢，试试哈，我一直用的TaKaRa的，新买了fermentas的酶试哈，我是按着你的方案做的，我发觉做分子靠运气！
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3楼2009-09-18 22:48:53
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你要了解为何切不动
PCR体系残存的Taq酶、dNTP、引物，以及不恰当的离子强度等，都是导致酶切失败的原因。
一般是要经过clean-up再酶切的
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4楼2009-09-19 08:56:53
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goonhetty

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR产物酶切时，引物要加保护碱基的！
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5楼2009-09-19 09:18:43
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
保险的，回收连T载再酶切再回收
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6楼2009-09-20 21:27:19
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