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04swlcm

金虫 (小有名气)


[交流] PCR产物直接酶切问题求助

最近做易错PCR方法的酶定向进化,转化老是不成功,现在找出原因是PCR产物直接酶切,没切出粘性末端,所以连不上,我一直用的是宝生物的酶,有时切4-6h,有时过夜都切不开。
希望请高手帮忙,提点意见和看法!谢谢了
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你要了解为何切不动
PCR体系残存的Taq酶、dNTP、引物,以及不恰当的离子强度等,都是导致酶切失败的原因。
一般是要经过clean-up再酶切的
4楼2009-09-19 08:56:53
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jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我们实验室用fermentas的酶试过,pcr产物酶切是可以切出来的,不过还是推荐pcr-回收-酶切-回收-连接  这个过程,虽然是麻烦了点。但是易错pcr就是追求小概率事件还是小心一点好,回收尽量用好的kit。
还有你的酶切位点是飘在引物上还是在你的pcr的条带上,最好还是放在引物上比较好,这样保证你可以切开,如果在易错pcr条带的范围内,很可能酶切位点就被直接突变了。
ps:你的金币够升级了

[ Last edited by jerryqpr on 2009-9-17 at 19:28 ]
铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
2楼2009-09-17 19:27:20
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04swlcm

金虫 (小有名气)


谢谢,试试哈,我一直用的TaKaRa的,新买了fermentas的酶试哈,我是按着你的方案做的,我发觉做分子靠运气!
3楼2009-09-18 22:48:53
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goonhetty

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物酶切时,引物要加保护碱基的!
5楼2009-09-19 09:18:43
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