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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助，为什么PET28a双酶切过夜大孔胶检测没有条带
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大姗

铜虫 (初入文坛)

[交流] 求助，为什么PET28a双酶切过夜大孔胶检测没有条带

用质粒pet28a做克隆载体，酶切位点是HindⅢ和XbaⅠ，和PCR片段一起双酶切过夜大孔胶电泳割胶。PCR片段跑带很清晰，pet28a什么都没有！用的是50微的体系，质粒加了15微，质粒鉴定过条带是正确的。
    后来专门只做pet28a的双酶切，以为是质粒浓度不够，加大质粒的量，20微，30微都做了，过夜酶切也是没有但是有次切了5小时左右有比较暗的带。
    请教高手，是什么原因？过夜酶切时间太长了？酶只切这两个点应该不会是时间的问题吧
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1楼 2009-09-17 16:00:35
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jessica533

新虫 (小有名气)
既然5小时后存在弱带，可能是你的酶切体系不宜切过夜，时间太长了
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把忧愁微掉，将快乐积起。
2楼2009-09-17 17:04:35
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xhlxhl

木虫 (正式写手)
切碎了？你用的什么公司的 内切酶（不纯的话，可能混有外切酶）~~~   酶切体系是什么样的
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3楼2009-09-17 17:27:04
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
有点像漏胶了。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-09-17 20:28:01
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
大姗(金币+1,VIP+0): 9-18 14:57
我也有过这样的经验，建议你加大酶切体系，如加大到100ul，其中加入质粒的量不变，酶切时间变短，2-3h,酶切后跑回收胶，如果条带还是不明显，那么就盲切回收酶切质粒。连接时加大回收质粒溶液的量。应该会有正确的单克隆长出的。
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5楼2009-09-17 21:06:41
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
大姗(金币+1,VIP+0): 9-18 14:58
HindⅢ和XbaⅠ需要过夜酶切吗，我没用过XbaⅠ，建议看看试剂说明，如果没有必要过夜就三四个小时就可以了。建议可以多切几个小体系20ul的一起上样，有时候大体系是会出问题，很难解释什么原因。
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6楼2009-09-18 09:57:12
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lju00

金虫 (小有名气)
我认为酶切的时间过长 把载体都切撒了
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7楼2009-09-18 10:28:44
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大姗

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jessica533 at 2009-9-17 17:04:
既然5小时后存在弱带，可能是你的酶切体系不宜切过夜，时间太长了

我也这样想过  但是师兄说原来做过没有问题的
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8楼2009-09-18 14:59:28
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大姗

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by xhlxhl at 2009-9-17 17:27:
切碎了？你用的什么公司的 内切酶（不纯的话，可能混有外切酶）~~~   酶切体系是什么样的

TAKARA公司的  应该没问题啊
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9楼2009-09-18 15:00:39
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大姗

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-17 21:06:
我也有过这样的经验，建议你加大酶切体系，如加大到100ul，其中加入质粒的量不变，酶切时间变短，2-3h,酶切后跑回收胶，如果条带还是不明显，那么就盲切回收酶切质粒。连接时加大回收质粒溶液的量。应该会有正确的 ...

谢谢  你的建议很有帮助  我尝试下
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10楼2009-09-18 15:01:55
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