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大姗

铜虫 (初入文坛)

[交流] 求助,为什么PET28a双酶切过夜大孔胶检测没有条带

用质粒pet28a做克隆载体,酶切位点是HindⅢ和XbaⅠ,和PCR片段一起双酶切过夜大孔胶电泳割胶。PCR片段跑带很清晰,pet28a什么都没有!用的是50微的体系,质粒加了15微,质粒鉴定过条带是正确的。
    后来专门只做pet28a的双酶切,以为是质粒浓度不够,加大质粒的量,20微,30微都做了,过夜酶切也是没有但是有次切了5小时左右有比较暗的带。
    请教高手,是什么原因?过夜酶切时间太长了?酶只切这两个点应该不会是时间的问题吧
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


大姗(金币+1,VIP+0): 9-18 14:57
我也有过这样的经验,建议你加大酶切体系,如加大到100ul,其中加入质粒的量不变,酶切时间变短,2-3h,酶切后跑回收胶,如果条带还是不明显,那么就盲切回收酶切质粒。连接时加大回收质粒溶液的量。应该会有正确的单克隆长出的。
5楼2009-09-17 21:06:41
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jessica533

新虫 (小有名气)

既然5小时后存在弱带,可能是你的酶切体系不宜切过夜,时间太长了
把忧愁微掉,将快乐积起。
2楼2009-09-17 17:04:35
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xhlxhl

木虫 (正式写手)

切碎了?你用的什么公司的 内切酶(不纯的话,可能混有外切酶)~~~   酶切体系是什么样的
3楼2009-09-17 17:27:04
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

有点像漏胶了。
Thank-you,so-blue.
4楼2009-09-17 20:28:01
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