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原味荧光杂交（FISH）细节求教 已有1人参与
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rt，楼主现在正在做FISH实验遇到了几个问题，想请教下各位同行。问题如下： 1. 原位杂交一般是有个带荧光的探针和DAPI复染，那请问在激光共聚焦上看的时候是选择荧光探针的激发和发射波长，还是说要包括DAPI的激发和发射波长，从而进行图片叠加呢？ 2. 像我们实验室激发波长最低是488nm，明显超过DAPI的340nm上限，那为什么我还能在激光共聚焦上看到有蓝色的部分？ 3. 用DAPI复染的目的是什么？是为了观察其他没携带探针的微生物吗？如果是，那可否不进行复染呢？ |
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2楼2023-01-15 15:08:41
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【答案】应助回帖
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首先要搞清楚杂交的对象 这个实验中杂交的对象是rRNA（即用于标记pepins中的核糖体） 所使用的nonsense探针是前面各个rRNA探针序列的互补链 用于排除rDNA的干扰 明白了这块的实验设计 再来看图 图A中使用的几种探针 都是针对细菌rRNA的探针 因此能够看到信号 图C中使用的nonsense探针 由于这些杂交的区域没有对应的DNA 自然没有信号 说明这些前面的信号不是rDNA的干扰 （DAPI通道下能看到一些点点可能是细胞中其他含有核酸分子的微小结构 ）两张图的信息加起来说明这里确实聚集了不少核糖体 由此 文章中得出了这样的结论 Fluorescence in situ hybridization (FISH) with probes specifically targeting ribosomal RNA sequences of Thiomargarita confirmed that ribosomes were indeed present and concentrated in these membrane-bound structures (Figs. 2 and S6 to S8), which were spread throughout the entire cell, including the apical buds (Fig. S8). |
8楼2023-02-05 11:59:37
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3楼2023-01-15 15:10:11
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【答案】应助回帖
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从原理的角度讲 FISH的探针通常标记一个比较小的片段 这种荧光信号太小 在低倍镜下很难找 DAPI这类复染剂的作用就是显示细胞核位置的 你看复染剂的英文counterstain 其中前缀counter-表示“相反的” stain表示“染色;染料” 一般的显微操作流程 也是先在低倍镜下用DAPI找到细胞对好焦 然后切到高倍镜 定下视野再切换到探针对应的通道来观察信号 至于最后一个问题 个人理解LZ的意思是问为什么肉眼能看到蓝光打在玻片上——因为DAPI的激发光属于紫外线范围 而滤光片会保留光谱上与激发光相近波长的光线 因此在光谱上与紫外线相邻的可见光（蓝紫色光）就被漏过了 一个类似的例子 实验室、医院里常用的紫外消毒灯在工作时 肉眼看也是发蓝紫色光 |
4楼2023-01-24 12:36:05
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十分感谢您的回复。另外我还有个小问题想再请教下：就是我下面A图是杂交的情况，而C图是无义杂交（没杂交的），就是我不太明白这两个有什么差别？明明都有染色，只是一个有亮点，一个没有，但这样会影响我们找到目标微生物吗？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2023-01-28 19:25:38
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